第一部分4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素及其與格爾德霉素生物合成PKS后修飾的關(guān)系;第二部分必特螺旋霉素生物合成調(diào)節(jié)基因acyB2在大腸桿菌中的異源表達(dá).pdf

1、第一部分:4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素及其與格爾德霉素生物合成PKS后修飾的關(guān)系
　　 格爾德霉素(geldanamycin，GDM)是一種苯（醌型）安莎類抗生素，是分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)的特異性抑制劑，具有抗腫瘤和抗病毒等生物學(xué)活性。但是，GDM具有嚴(yán)重的肝臟毒性，且水溶性和光穩(wěn)定性較差，限制其開(kāi)發(fā)成為藥物，因此，它只作為一個(gè)重要的抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)先導(dǎo)化合物。近年來(lái)，尋找水溶性好

2、、肝毒性低的格爾德霉素衍生物成為新的研究熱點(diǎn)。
　　 本文通過(guò)對(duì)吸水鏈霉菌17997格爾德霉素生物合成PKS后修飾gdmNˉ（編碼氨甲?；D(zhuǎn)移酶）變株的次級(jí)代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)預(yù)期的新格爾德霉素衍生物,4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素。gdmNˉ變株發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取后，進(jìn)行硅膠板TLC分析；對(duì)一個(gè)紅色目標(biāo)化合物進(jìn)行HPLC和高分辨質(zhì)譜分析，并對(duì)其進(jìn)行了1H-和13C-核磁共振分析；對(duì)紅色

3、目標(biāo)化合物在吸水鏈霉菌17997格爾德霉素PKS基因阻斷變株中進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：顯示：在gdmNˉ變株發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)預(yù)期的紅色目標(biāo)化合物（4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素）：該化合物可被格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)7-O-氨甲?；?,5-雙氫-19-S-甲基格爾德霉素，但不能C-4,5氧化。
　　 4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾

4、德霉素的發(fā)現(xiàn)，以及早期發(fā)現(xiàn)的19-S-甲基格爾德霉素和4,5-雙氫-19-S-甲基格爾德霉素，加深了對(duì)天然存在于吸水鏈霉菌17997格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)以外修飾的認(rèn)識(shí)。通過(guò)分析生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，證實(shí)19-S-甲基化修飾對(duì)格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)中的氨甲?；瘺](méi)有影響，而對(duì)C-4,5氧化具有抑制作用。
　　 第二部分:必特螺旋霉素生物合成調(diào)節(jié)基因acyB2在大腸桿菌中的異源表達(dá)
　　 必特螺旋霉素是由基

5、因工程重組菌StreptomycesspiramyceticusWSJ-1產(chǎn)生的一組以4"異戊酰螺旋霉素為主組分的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。將來(lái)自碳霉素生物合成中的4"異戊?；D(zhuǎn)移酶（ist,carE或acyB1）基因?qū)氲铰菪顾禺a(chǎn)生菌中，所表達(dá)的酶可以對(duì)螺旋霉素進(jìn)行4"異戊?；?br>　　 已知acyA和acyB1-acyB2這3個(gè)基因，acyA主要負(fù)責(zé)十六元內(nèi)酯環(huán)上C3-羥基的乙?；６鴄cyB1-acyB2負(fù)責(zé)十六元內(nèi)酯環(huán)C

6、5上連接的糖基的異戊?；?。acyB1基因編碼4"異戊?；D(zhuǎn)移酶。Arisawa等人推測(cè)acyB2基因是acyB1基因的正調(diào)控基因，但是acyB2的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)acyB1基因的調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)并不清楚。本研究的目的是確證acyB2基因表達(dá)產(chǎn)物的DNA結(jié)合區(qū)，為acyB2基因是acyB1基因的正調(diào)控基因提供直接證據(jù)；同時(shí)，將為應(yīng)用生物技術(shù)手段構(gòu)建必特螺旋霉素高產(chǎn)菌株提供更加堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
　　 我們首先將acyB2基因克隆到pMD18

7、-TSimpleVector上，獲得pMA01基因重組質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。然后，采用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，切下acyB2基因并插入到冷休克表達(dá)載體pColdⅡVector（利用大腸桿菌冷休克基因cspA啟動(dòng)子序列的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，采用低溫誘導(dǎo)方法，蛋白質(zhì)表達(dá)量和可溶性較高）中，獲得pCA01重組質(zhì)粒。將pCA01重組質(zhì)粒導(dǎo)入到E．coliCompetentCellBL21中進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。隨后嘗試更換表

8、達(dá)宿主，ChaperoneCompetentCellsBL21系列——分別含有一種伴侶蛋白質(zhì)粒，能有效表達(dá)一組協(xié)同作用、共同參與蛋白折疊的分子伴侶（以增加可溶性蛋白表達(dá)水平），但仍沒(méi)有獲得可溶性目的蛋白。最后，我們對(duì)以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性。
　　 acyB2與acyB1間有段約300bp的DNA片段，我們推測(cè)其中可能包含acyB2編碼蛋白的DNA結(jié)合區(qū)（以正調(diào)控acyB1轉(zhuǎn)錄表達(dá)）。我們?cè)O(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增該

9、300bpDNA片段，標(biāo)記后作為探針，利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，以確證acyB2蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)，但是沒(méi)有成功。
　　 第三部分：重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的研究進(jìn)展
　　 長(zhǎng)期以來(lái)，大腸桿菌是表達(dá)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)，但有時(shí)表達(dá)的目的蛋白卻未進(jìn)行正確的折疊而形成包涵體。人們?cè)诒磉_(dá)不同的目的蛋白時(shí)采用了多種方法以期獲得具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，包括優(yōu)化培養(yǎng)條件、融合標(biāo)簽的使用和共表達(dá)分子伴侶等。本文綜述了近年來(lái)在大腸桿菌