達(dá)托霉素優(yōu)質(zhì)高效生物合成的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、達(dá)托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)生產(chǎn)的新型環(huán)脂肽類抗生素，具有廣譜的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性，為萬(wàn)古霉素產(chǎn)生耐藥性后的新型微生物藥物。目前，有關(guān)達(dá)托霉素的分子結(jié)構(gòu)及改造、生物合成機(jī)制、抗菌機(jī)制及其理化活性等方面已有廣泛研究。達(dá)托霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的同系物A21978C1-3對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)品的品質(zhì)影響很大，但同系物的合成如何調(diào)控，以及整個(gè)生物合成過(guò)程的調(diào)控機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究針對(duì)達(dá)托霉素工業(yè)菌

2、玫瑰孢鏈霉菌L30，主要研究多效調(diào)控因子對(duì)達(dá)托霉素生物合成過(guò)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及支鏈脂?；绑w對(duì)同系物合成的調(diào)控機(jī)制。
　　本文建立了基于Himar1轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的基因組水平調(diào)控因子體內(nèi)篩選體系，以及基于DNA-蛋白親和純化技術(shù)的蛋白質(zhì)組水平調(diào)控因子體外篩選體系，成功篩選到重要多效調(diào)控因子PhaR和AtrA。實(shí)驗(yàn)表明，PhaR蛋白是達(dá)托霉素合成基因簇中dptE基因的負(fù)調(diào)控因子，phaR基因缺失菌株的達(dá)托霉素中試放大發(fā)酵單位較野生型提

3、高了42.5％，達(dá)926mg/L;調(diào)控因子PhaR通過(guò)直接結(jié)合dptE基因啟動(dòng)子抑制達(dá)托霉素合成基因簇的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控達(dá)托霉素的生物合成。PhaR還對(duì)自身編碼基因表現(xiàn)出正調(diào)控和反饋調(diào)控作用，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移逐漸解除對(duì)下游基因的抑制效應(yīng)。AtrA是TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在鏈霉菌中非常保守，其通過(guò)直接結(jié)合dptE基因的啟動(dòng)子進(jìn)而正調(diào)控達(dá)托霉素的生物合成。另一個(gè)多效調(diào)控因子AdpA是玫瑰孢鏈霉菌A-因子信號(hào)通路下游非常保守的效應(yīng)蛋白，

4、它能夠通過(guò)結(jié)合atrA基因啟動(dòng)子正調(diào)控atrA基因的表達(dá)，從而間接正調(diào)控達(dá)托霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，A-因子信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑中，A-因子受體蛋白ArpA對(duì)adpA基因的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用?；诖苏{(diào)控機(jī)制，我們敲除了arpA基因，使達(dá)托霉素的發(fā)酵單位提高了2.5倍。
　　本文同時(shí)研究了支鏈脂?；绑w對(duì)達(dá)托霉素同系物A21978C1-3合成的調(diào)控機(jī)制。玫瑰孢鏈霉菌基因組上含有兩個(gè)支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合體編碼基因簇bkdA1B1C1和

5、bkdA2B2C2，以及與bkdA2B2C2成簇的調(diào)控因子基因bkdR。研究發(fā)現(xiàn)BkdR正調(diào)控了bkdA2B2C2基因簇的表達(dá)，但是對(duì)達(dá)托霉素合成的正調(diào)控作用并非通過(guò)影響其基因簇表達(dá);同時(shí)BkdR對(duì)自身編碼基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。敲除bkdA2B2C2基因簇僅能部分降低發(fā)酵提取物中A21978C1-3同系物組分含量，而敲除bkdA1B1C1基因簇能顯著減少A21978C1-3同系物生成，表明在代謝分解支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨酸合成含支鏈

6、的脂肪酸過(guò)程中，bkdA1B1C1基因簇起主導(dǎo)作用，bkdA2B2C2是輔助基因簇。我們構(gòu)建了同時(shí)敲除bkdA1B1C1/bkdA2B2C2基因簇的工程菌，消除A21978C1-3同系物組分生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了達(dá)托霉素的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。
　　本文揭示了玫瑰孢鏈霉菌中達(dá)托霉素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及A-因子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制，通過(guò)遺傳改造實(shí)現(xiàn)了達(dá)托霉素的高效合成;同時(shí)闡釋了支鏈脂?；绑w對(duì)達(dá)托霉素同系物A21978C1-3合成的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)定向