實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)克羅諾桿菌的研究.pdf

1、克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種普遍存在于自然環(huán)境中的條件致病菌，不但存在于被污染的食品和食品工廠中，還幾乎能夠從所有的環(huán)境中分離得到。感染克羅諾桿菌的高危人群是嬰幼兒，死亡率高達(dá)20％～50％，幸存下來(lái)的嬰幼兒也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、靈敏、高效、可靠的檢測(cè)克羅諾桿菌的方法是至關(guān)重要的。
　　實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RF-SPIA)是以單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)為理論依據(jù)

2、，將熒光染料與SPIA技術(shù)相結(jié)合，利用恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(DEAOUARTⅡ)，將實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀與電腦相連，通過熒光信號(hào)的積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，可自動(dòng)判定反應(yīng)結(jié)果的陰性與陽(yáng)性，并生成反應(yīng)結(jié)果圖。
　　根據(jù)克羅諾桿菌在GenBank中16S rRNA基因(HQ880288.1)，利用軟件PrimerPremier5.0、DNAMAN設(shè)計(jì)RF-SPIA引物及Blocker，對(duì)反應(yīng)體系中各添加物條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25μL的RF-

3、SPIA的反應(yīng)體系:25 mmol/L MgSO40.8μL，10 mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L引物2.0μL，2×BcaDNA聚合酶緩沖液2.0μL，5×RNaseH緩沖液1.5μL，40 U/μL核糖核酸抑制劑0.6μL，20 mg/mL Bovine Serum Albumin0.9μL，10μmol/L Blocker1.0μL，20 U/μL BcaDNA聚合酶1.0μL，60 U/μL RNaseH0.

4、6μL，模板1.0μL，SYBR GreenⅡ(1∶400)1.0μL，RNase-free Water補(bǔ)足反應(yīng)體系。RF-SPIA反應(yīng)程序:掃描頻率為60 s一次，反應(yīng)溫度為61℃，反應(yīng)時(shí)間120 min（通過觀察反應(yīng)情況隨時(shí)停止）。
　　本研究以15株克羅諾桿菌和29株非克羅諾桿菌作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行RF-SPIA試驗(yàn)的引物特異性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果均為克羅諾桿菌株，其余非克羅諾桿菌菌株結(jié)果均顯示陰性，由此證明試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性

5、高，可用于克羅諾桿菌的檢測(cè)。本試驗(yàn)對(duì)克羅諾桿菌純培養(yǎng)的靈敏度達(dá)到1.4×100 CFU/mL，對(duì)克羅諾桿菌基因組的靈敏度達(dá)到7.5×101 fg/mL，將克羅諾桿菌人工污染嬰幼兒配方奶粉，并測(cè)定其檢出限達(dá)到8.1×102 CFU/g。通過離心沉淀及紫外照射，試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼直接觀察。
　　本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌的方法特異性強(qiáng)、靈明度高，方便快捷，還可肉眼觀察結(jié)果。該檢測(cè)方法不需要繁瑣