克羅諾桿菌免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究.pdf

1、克羅諾桿菌是一種腸桿菌科的食源性致病菌，其感染能夠?qū)е履X膜炎，小腸結(jié)腸炎和敗血癥，致死率為50％-80％,僥幸存活者依然會(huì)遭受終生的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥?？肆_諾桿菌主要感染人群為各個(gè)年齡階段的免疫力低下人群，尤其以低體重，出生不足月的新生兒為甚。目前通過(guò)流行病學(xué)的研究，已經(jīng)將新生兒感染與被污染的嬰幼兒配方奶粉聯(lián)系起來(lái)。因此2004年FAO/WHO在日內(nèi)瓦的一次會(huì)議中將克羅諾桿菌和沙門氏菌列為嬰幼兒配方奶粉中存在的兩種A類致病菌。目前我國(guó)對(duì)于克

2、羅諾桿菌的檢測(cè)主要依賴于常規(guī)的生理生化檢測(cè)方法，該方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，至少需要5天才能獲得結(jié)果。此外，這種檢測(cè)方法主要是對(duì)克羅諾桿菌屬的檢測(cè)，而本屬的菌株在自然界中的分布，致病性和毒力均存在著差異，阪崎克羅諾桿菌是分離出來(lái)的菌株中數(shù)量最多的，約占本屬的2/3，并且阪崎克羅諾桿菌C.sakazakiiST4在歐洲大陸的爆發(fā)案例中扮演了重要角色。因此有必要發(fā)展快速準(zhǔn)確的克羅諾桿菌乃至阪崎克羅諾桿菌檢測(cè)方法。本論文中，主要從以下幾個(gè)部分

3、對(duì)克羅諾桿菌的快速檢測(cè)方法進(jìn)行了研究:
　　(1)抗克羅諾桿菌單鏈抗體scFvH81的構(gòu)建及表達(dá)
　　提取實(shí)驗(yàn)室保存的雜交瘤細(xì)胞RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用通用引物組擴(kuò)增，并選擇符合大小的序列測(cè)序。通過(guò)IMGT/V-QUEST對(duì)這些序列進(jìn)行分析，最終選擇了符合開(kāi)放閱讀框的H81和L11序列作為構(gòu)建單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因。通過(guò)SOE-PCR的方法將H81，L11和一個(gè)柔性Linker連接起來(lái)構(gòu)建為單鏈抗體，并命名為scF

4、vH81。使用包涵體變性復(fù)性的方法制備單鏈抗體，其步驟簡(jiǎn)單，過(guò)程極短，僅僅需要5天即可制備出大量的單鏈抗體。制備的單鏈抗體具有較好的特異性，其親和力常數(shù)為2.39±0.06×106 M-1。
　　(2)抗克羅諾桿菌單鏈抗體scFvH81生物信息學(xué)分析
　　通過(guò)IMGT/V-QUEST分析序列，分析單鏈抗體scFvH81，分析其V(D)J重排機(jī)制，及其胚性基因來(lái)源，劃分出單鏈抗體scFvH81可變區(qū)和骨架區(qū)。使用ProtPar

5、amtool分析單鏈抗體scFvH81，其等電點(diǎn)為7.05，因此選擇包涵體的復(fù)性液pH為8.0，有利于單鏈抗體的復(fù)性。使用SOPMA和I-TASSAR預(yù)測(cè)單鏈抗體scFvH81的二級(jí)結(jié)構(gòu)和3-D模型，并進(jìn)行對(duì)接，找到了抗原-抗體結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸，這些關(guān)鍵氨基酸通常位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的β轉(zhuǎn)折附近。結(jié)合單鏈抗體3-D模型空間結(jié)構(gòu)并錯(cuò)開(kāi)其關(guān)鍵氨基酸引入二硫鍵，以減少對(duì)單鏈抗體scFvH81活性的影響，但單鏈抗體scFvH81特異性發(fā)生變化，這證

6、明二硫鍵的引入還需要考慮其他因素的影響。
　　(3)克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測(cè)方法的建立
　　以阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii ATCC BAA-894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)對(duì)克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)進(jìn)行了篩選，共篩選出了22個(gè)特異性靶點(diǎn)，根據(jù)這些特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，最終獲得了一對(duì)特異性引物N2。以該對(duì)引物為基礎(chǔ)建立具有較好的抗干擾能力的PCR檢測(cè)方法，其純茵培養(yǎng)物檢測(cè)限為102 CFU/mL

7、;基因組DNA檢測(cè)限為128 fg/μL。該檢測(cè)方法在人工污染實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)8h的培養(yǎng)，可以檢測(cè)出人工污染奶粉中接種量為3.5×100 CFU的克羅諾桿菌。
　　(4)阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測(cè)方法的建立
　　以阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii ATCC BAA-894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)工具，篩選出了38組阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)，以這些特異性靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，篩選出來(lái)了3對(duì)特異性引物（CS14，

8、CS21和CS38）并建立了具有較好的抗干擾能力的PCR檢測(cè)方法，其基因組靈敏度分別為1.35 pg/μL，135 fg/μL，和135 fg/μL;其純菌培養(yǎng)物靈敏度為5.5×105 CFU/mL，5.5×103 CFU/mL，5.5×103 CFU/mL。經(jīng)過(guò)8h的預(yù)培養(yǎng)，引物對(duì)CS21和CS38在人工污染奶粉中的檢測(cè)限為5.5×10-1CFU/10g。
　　(5)阪崎克羅諾桿菌種熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
　　本研究