人體寄生蟲分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究進(jìn)展

1、“動(dòng)物學(xué)研究”系列講座,程 喆廈 門 大 學(xué) 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院,人體寄生蟲分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究進(jìn)展,1 概述：,人體寄生蟲學(xué)定義 人體寄生蟲學(xué)（human parasitology）是研究與人體健康有關(guān)的寄生蟲的形態(tài)、生活史、致病、實(shí)驗(yàn)診斷方法、流行因素與防治措施的科學(xué)，是預(yù)防醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的一門基礎(chǔ)學(xué)科。,一、前言,按動(dòng)物分類系統(tǒng)分類，人體寄生蟲隸屬于動(dòng)物界的五個(gè)門：原生動(dòng)物門（Phylum Protozoa

2、)——原蟲扁形動(dòng)物門（Phylum Platyhelminthes)——吸蟲、絳蟲線形動(dòng)物門（Phylum Nemathelminthes)——蛔蟲棘頭動(dòng)物門（Phylum Acanthocephala)——棘頭蟲節(jié)肢動(dòng)物門 (Phylum Arthropoda)————醫(yī)學(xué)昆蟲 習(xí)慣上分為：原蟲、蠕蟲(吸蟲、絳蟲、線蟲)、醫(yī)學(xué)昆蟲三大類。,2 人體寄生蟲分類,現(xiàn)代熱帶病 （WHO 2000） 瘧疾 （ma

3、laria） 感染人數(shù)4億～4.9億；每年死亡人數(shù)220～250萬。 血吸蟲病 （schistosomiasis） 流行于76個(gè)國家，5億~6億人口受威脅， 2 億人感染，每年死亡人口50～100萬。 絲蟲?。馨秃捅P尾絲蟲病 filariasis) 流行于80多個(gè)國家，1.45億人感染。,3 寄生蟲的危害性,晚期絲蟲病人（下肢象皮腫）,晚期血吸蟲病人,利什曼病（leishmaniasi

4、s）現(xiàn)感染人口1200萬人錐蟲?。ǚ侵藓兔乐掊F蟲 trypanosomiasis） 單單美洲錐蟲感染者1800萬。麻風(fēng)病 （leprosy）結(jié)核病 （tuberculosis）登革熱 （date-fever）,媒介昆蟲傳染的疾病,東方癤,,4 背景： 動(dòng)物寄生蟲的分子生物學(xué)研究始于20世紀(jì)90年代中期，雖然起步較晚，但進(jìn)展極快。近10年來，研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲，并已擴(kuò)展到了具有重要公共衛(wèi)生

5、意義的部分寄生蠕蟲，研究深度已進(jìn)入寄生蟲的基因序列測定分析、分類比對(duì)鑒定、診斷方法的建立和免疫學(xué)研究領(lǐng)域，建立了近50種寄生蟲的cDNA文庫。,5 意義：☆ 揭示生命科學(xué)的規(guī)律。 ☆ 為動(dòng)物寄生蟲病的研究和防控工作展示了新的前景。,二、寄生蟲基因組學(xué)研究進(jìn)展,1. 寄生蟲的基因組成和特點(diǎn) 相對(duì)于高等脊椎動(dòng)物,寄生蟲基因組除了核(染色體)DNA之外,還有線粒體(mitochondrian)DNA、動(dòng)基體(kineto-pl

6、ast)DNA（利什曼原蟲，分類和臨床診斷）和質(zhì)體(plastid)DNA （頂復(fù)門寄生蟲，如：瘧原蟲、弓形蟲、巴貝蟲和艾美球蟲，分類和臨床診斷）等。在一些低等的寄生原蟲中,甚至沒有成型的線粒體DNA,如某些阿米巴除了染色體DNA外,只有類似細(xì)菌質(zhì)粒的環(huán)狀DNA和胞質(zhì)DNA。,基因組大小:寄生蟲染色體基因組的大小差別較大,其中,微孢子蟲Microsporidia基因組的大小不到10 Mb,在整個(gè)真核生物中最小;血吸蟲基因組為270 Mb

7、,相當(dāng)于人類基因組的1/10重復(fù)序列：高度、中度和單拷貝重復(fù)序列, 不同的寄生蟲重復(fù)序列所占的比例不同堿基含量:寄生蟲基因組堿基G+C含量在30% - 40%之間,AT含量豐富,線粒體DNA： 線粒體DNA具有母系遺傳和快速進(jìn)化的特點(diǎn),較染色體DNA更易反映種、株乃至型間差異,由于具有較好的穩(wěn)定性,因此通常被用來評(píng)價(jià)物種的種系發(fā)生。目前已對(duì)血吸蟲、惡性瘧原蟲、弓形蟲、單殖吸蟲(Microcotyle sebastis,

8、G. thymalli, G. salaris, G. derjavin-oides)、血吸蟲(S. japonicum, S. mekongi, S. mansoni, S.haematobium, S. spindale)、肝片吸蟲Fasciola hepatica、衛(wèi)氏并殖吸蟲Paragonimuswestermani及絳蟲(Hymenolepis diminuta,Taenia asiatica, T. solium, T. c

9、rassiceps, E. multilocularis, E. granulosus)等多種寄生蟲的全線粒體基因組作了測序分析(Littlewoodet al., 2006; Valles& Boore, 2006; Parket al., 2007; Plaisanceetal., 2007; Huyseetal., 2007、2008)。,2.　寄生蟲基因組測序現(xiàn)狀,目前寄生蟲基因組測出的序列主要分3類:A.完整或接近完

10、整的基因組序列,主要是可讀框區(qū)的重復(fù)序列,通常用重疊群(contigs)表示; B.基因組測序序列標(biāo)簽(GSSs),主要有瀏覽基因組序列產(chǎn)生或隨機(jī)克隆、細(xì)菌人工載體(BAC)末端序列,用來擴(kuò)增大片段的DNA（200 kb左右);C.表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs),由mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA,并擴(kuò)增后進(jìn)行的測定序列。,已經(jīng)完成基因組測序的寄生蟲包括惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲P. yoelii、馬來布魯線蟲Brugia malayi、克氏錐蟲T

11、. cruzi、小隱孢子蟲Cryptosporidium parvum及岡比亞按蚊Anopheles gambiae等的基因組全序列,意義：☆ 基因組分析過程中發(fā)現(xiàn)了大約200種蛋白的基因，這些蛋白質(zhì)參與了免疫逃避。以前的研究顯示，在某種復(fù)雜的掩護(hù)機(jī)制之下，寄生蟲通過在細(xì)胞表面表達(dá)不同的蛋白質(zhì)來逃避宿主的免疫反應(yīng)?！?發(fā)現(xiàn)編碼參與代謝途徑蛋白的基因，蟲體存在而人體不存在的特有途徑中的基因是潛在的藥物靶標(biāo)。,☆ 比較惡性瘧原蟲與瘧

12、原蟲其他種的序列，可以闡明特定株特異性的基因和生理過程。或者比較惡性瘧原蟲不同株的序列，可以快速地鑒定與免疫、發(fā)病機(jī)制和人侵有關(guān)的變異?！?通過功能基因組高通量技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)DNA微陣列檢測基因的表達(dá)。例如，分離不同時(shí)期的DNA微陣列，確定基因的表達(dá)變化，對(duì)于特別重要的基因可用敲除或修飾的方法來確定功能。,枯氏錐蟲——DNA復(fù)制和修復(fù)機(jī)器 ;布氏錐蟲——代謝的途徑和一些細(xì)胞生物學(xué) ;碩大利什曼原蟲——不尋常的基因表達(dá)

13、等問題；基因組都是單倍體，長度從25到55Mb大小不等；多數(shù)基因都以長且定向的聚集方式組合在一起，暗示主要是以多順反子地形式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，隨后被切割成單獨(dú)的mRNA分子。,在三個(gè)基因組中很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的基因存在，但高表達(dá)一些含有RNA結(jié)合基序的蛋白質(zhì)。這些觀察結(jié)果支持了先前的觀點(diǎn)，就是錐蟲基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。缺乏轉(zhuǎn)錄水平的精確調(diào)控帶來了一個(gè)有趣的結(jié)果：,只有通過基因的復(fù)制或擴(kuò)增來增加表達(dá)水平的提高。,從DNA復(fù)制

14、和修復(fù)的角度來看，錐蟲類和真核生物的其他生物區(qū)別很大。基因組不包含牽涉到應(yīng)對(duì)氧脅迫的基因；復(fù)制起始裝置更像古菌，而非真核生物（生物學(xué)和進(jìn)化學(xué)上的興趣 ）。 錐蟲類特異性蛋白激酶，類細(xì)菌的線粒體DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修飾都可以作為潛在的藥物靶位點(diǎn)。,編碼基因13469個(gè),其中有首次發(fā)現(xiàn)的與血吸蟲感染宿主密切相關(guān)的彈力蛋白酶基因。日本血吸蟲一方面丟失了很多與營養(yǎng)代謝相關(guān)的基因,如脂肪酸、氨基酸、膽固醇和性激素合成基因

15、等,這些營養(yǎng)物質(zhì)必須從哺乳動(dòng)物宿主獲得;另一方面,擴(kuò)充了許多有利于蛋白消化的酶類基因家族的成員。 與宿主相互作用蛋白。,Wellcome Trust Sanger Institute,原蟲：瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲、孢子蟲…蠕蟲：包括蛔蟲、肝包蟲、馬來絲蟲，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，管圓線蟲…,絳蟲丟失了homeobox 基因和一些干細(xì)胞關(guān)鍵基因如piwi蛋白基因，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70和其他一些抗原基因存在種特異性擴(kuò)增。

16、 比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絳蟲存在特異的解毒途徑，以及依賴宿主營養(yǎng)物質(zhì)的代謝方式。確定了現(xiàn)有藥物可能的作用靶點(diǎn)，為研發(fā)高效新疫苗和新藥物提供理論支持，給有效預(yù)防和控制絳蟲病帶來新的希望。,第三代測序技術(shù),◆ 它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，是化學(xué)法測序的2萬倍?！?它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基?！?/p>

17、 精度高，達(dá)到99.9999%。,二、微衛(wèi)星DNA的研究進(jìn)展及其在寄生蟲學(xué)的應(yīng)用,定義：微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),又稱短小串連重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)或簡單重復(fù)序列(simple repeats sequence,SRS或SSR)。相對(duì)于衛(wèi)星序列和小衛(wèi)星序列,微衛(wèi)星的重復(fù)序列更短,一般只有1 bp~6 bp、長度僅為幾百個(gè)bp的位點(diǎn)。微衛(wèi)星重復(fù)類型有兩種,即單核

18、苷酸(A/T、C/G等)和4種二核苷酸(AT/TA、AG/TC、TG/AC、CG/GC)。AC/TG約占50%以上,三、四核苷酸重復(fù)類型和其他類型的要少一些。,優(yōu)點(diǎn)： 微衛(wèi)星DNA具有RFLP、SSLP、RAPD等遺傳標(biāo)記技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢☆ 種類分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性、重組率低,☆ 在群體中變異范圍大、長度多態(tài)性豐富、高度個(gè)體特異性、基因組中且分布比較均勻☆ 基因片段小、容易操作☆ 遵循孟德爾共顯性

19、遺傳規(guī)律、能提供眾多有高度遺傳信息的新的多態(tài)性標(biāo)記,意義：微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記被應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳育種、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳學(xué)研究、疾病相關(guān)基因、免疫和遺傳變異機(jī)制的研究。,寄生蟲微衛(wèi)星DNA,寄生蟲與宿主在進(jìn)化過程中的相互關(guān)系,為闡明寄生蟲的進(jìn)化史提供更有價(jià)值的依據(jù);宿主對(duì)寄生蟲免疫機(jī)制;抗藥性蟲株的變異機(jī)制及寄生蟲藥物的篩選;影響寄生蟲流行和傳播的因素,這些因素如何導(dǎo)致變異等方面。,三、寄生蟲的反式剪接,定義： 反式剪

20、接最早發(fā)現(xiàn)于錐蟲(Trypanosome)可變表面糖蛋白(VSG)基因中。VSG基因轉(zhuǎn)錄后成熟mRNA 5′端35 bp是其基因中沒有的,這段序列來自另外一基因的小外顯子(mini exon)或SL (spliced leader),這段外來的序列與VSG的mRNA 5′端接合形成成熟的mRNA。這種由來自不同基因mRNA通過剪接形成成熟mRNA的剪接方式稱為反式剪接。SL反式剪接廣泛存在于低等真核生物中,雖然各種生物體SL RNA

21、長度,SL DNA長度,SL基因拷貝數(shù)不盡相同,但SL RNA及SL反式剪接的現(xiàn)象已被廣泛證明,而且越來越多的研究者在關(guān)注和應(yīng)用這一生物現(xiàn)象。,反式剪接與順式剪接有相似之處也有不同之處。相同的是它們中都存在典型的剪接位點(diǎn),都需要同樣的snRNP來參與。,特點(diǎn)：SL RNA長約100 bp,其中有一Sm樣蛋白結(jié)合位點(diǎn), SL RNA的Sm樣蛋白結(jié)合位點(diǎn)和U6 SnRNA堿基配對(duì)可在體外進(jìn)行,推測這一反應(yīng)可能吸引SL RNA于剪接體中,從

22、而觸發(fā)了這一反式剪接的進(jìn)行。二級(jí)結(jié)構(gòu)還有兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。SL RNA高度甲基化形成帽子結(jié)構(gòu)。突變SL RNA失去高度甲基化形成帽子結(jié)構(gòu)的能力,會(huì)導(dǎo)致不能正常地完成反式剪接。反式剪接中至少兩步需要有SR蛋白的參與,在U2 SnRNP加到3′端受體之前和之后,SR蛋白發(fā)揮重要作用。主要是通過SR蛋白的RS區(qū)磷酸化來觸發(fā)已和U2 SnRNP結(jié)合的SL RNA反式剪接。,意義：☆ 應(yīng)用SL保守序列作為基因標(biāo)簽來獲得功能性基因或構(gòu)建SL cD

23、NA文庫。SL cDNA文庫的構(gòu)建和分析可能為寄生蟲免疫功能基因的篩選，以及研究寄生蟲的階段特異性表達(dá)提供了更加方便、快捷的手段。,☆ SL RNA反式剪接可作為一種重要的修復(fù)RNA外顯子突變的方法,將正?；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕蚱芜B接到SL序列上,在SL的引導(dǎo)下將正常的RNA序列經(jīng)反式剪接換下突變的部分,達(dá)到修復(fù)的目的。,☆ 原核生物不存在的細(xì)胞核,沒有mRNA的后加工過程;真核生物有細(xì)胞核,轉(zhuǎn)錄初始mRNA要經(jīng)過一系列的后加工過程

24、。而在低等真核生物中的初始mRNA經(jīng)反式剪接在5′端加上含有高度甲基化的帽子結(jié)構(gòu)(cap4)的SL RNA,似乎與典型真核生物中5′端帽化很相似,從進(jìn)化角度,這種反式剪接是一種進(jìn)化過度形式,這種形式是從原始的一共同祖先進(jìn)化而來,還是不同的群體各自進(jìn)化而來還有待進(jìn)一步研究。,,四、RNA干擾技術(shù)在人體寄生蟲研究中的應(yīng)用進(jìn)展,RNA干擾技術(shù)簡介,RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種在真核生物中普遍存在的自身防御反

25、應(yīng),是內(nèi)源或外源性雙鏈RNA (double stranded RNA, dsRNA)引起細(xì)胞內(nèi)有效的特異基因關(guān)閉或基因沉默現(xiàn)象。,1. dsRNA被RNA酶Ⅲ家族中的雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶Dicer特異性識(shí)別,隨后降解為21~23個(gè)核苷酸長度的3′末端突出2個(gè)核苷酸的siRNA ( small interfering RNA)。2. siRNA生成后融入一大分子多蛋白復(fù)合體——RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC), siRNA隨即解

26、鏈為正義鏈和反義鏈。3. 若目的mRNA中有部分序列與siRNA的反義鏈互補(bǔ),則siRNA的反義鏈可與之互補(bǔ)配對(duì)并將mRNA在互補(bǔ)區(qū)的中間部分降解,從而引起轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。,dsRNA /siRNA介導(dǎo)途徑,RNAi技術(shù)的特點(diǎn)☆　高穩(wěn)定性　以3′端突出TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定,無需象反義核酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期?！睢「叨葘Ｒ恍浴〖磀sRNA具有高度的特異性,它只能引起與dsRNA同源的基因表達(dá)活性大幅度降低,即

27、RNAi有同源基因依賴性。siRNA除正義鏈3′端的3個(gè)堿基在序列識(shí)別中不起主要作用外,其他單個(gè)堿基改變就可能使RNAi失效,而針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因共同失活。,RNAi技術(shù)的特點(diǎn)☆　高效性　RNAi機(jī)制中存在催化或放大的步驟,少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá),能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下研究目標(biāo)基因,比基因敲除更簡單,更快捷。而且,那些在胚胎中敲除后導(dǎo)致死亡的基因,也可以利用RNAi的方法

28、在培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行研究?！睢「叽┩感浴NAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限,在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持,在線蟲中干擾效應(yīng)甚至可以傳到后代去。,RNAi技術(shù)鑒定布氏錐蟲基因功能,五、寄生蟲Micro RNA的研究進(jìn)展,定義：miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，在動(dòng)物中來源于長度約70 bp～90 bp的前體。前體經(jīng)過雙鏈RNA特異性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最終形成18 nt～2

29、2 nt長度的成熟，然后通過與靶mRNA 3‘端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合導(dǎo)致靶基因翻譯阻遏或者降解，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控。 1993年在秀麗新桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7，發(fā)現(xiàn)為寄生蟲的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供了新的契機(jī)。,miRNA和siRNA之間的關(guān)系MiRNA：是非編碼的單鏈小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性；miRNAs通常是由較大的（70～90

30、 nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）前體經(jīng)Dicer酶切割得到的。miRNAs則廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。 siRNA：針對(duì)編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個(gè)siRNAs，是通過降解目標(biāo)靶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。也要經(jīng)Dicer酶切割dsRNA得到。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還沒有找到內(nèi)源siRNA。,血吸蟲Micro RNA,Xue等在日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)了5種新的miRNA，其中4種具有保守性的miR

31、NA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125和sja-bantam)，1種(sja-miR-new1)為血吸蟲特有。對(duì)這5種新的miRNA在日本血吸蟲6個(gè)發(fā)育期中表達(dá)情況的分析表明，這些miRNA表現(xiàn)出高度的期特異性。☆ let-7：高度的期特異性；毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的12倍，在尾蚴期達(dá)到高峰。因此，推測let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調(diào)控相關(guān)?！?sja-miR-71、sja-ba

32、ntam：毛蚴期開始表達(dá)，尾蚴期達(dá)到高峰。而尾蚴是血吸蟲的感染期，當(dāng)尾蚴進(jìn)入宿主動(dòng)物細(xì)胞后，sja-miR-71的表達(dá)立刻降到最低水平然后進(jìn)入童蟲期，并在此后的生命活動(dòng)過程中始終保持在較低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表達(dá)量高于童蟲期近1000倍，sja-bantam高達(dá)500倍。表達(dá)量的變化與生活周期變化相關(guān)，與性別無關(guān)。,,藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Micro RNA,藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是miRNA研究中第一個(gè)經(jīng)過克隆和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的原蟲?，F(xiàn)在

33、已經(jīng)明確，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的至少4種miRNA來源于細(xì)胞內(nèi)的小核仁RNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)。,起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了寄生原蟲的調(diào)節(jié)性小RNA的來源。該研究首次提出miRNA來源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身編碼，意味著在miRNA介導(dǎo)的基因沉默過程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑。這種現(xiàn)象也意味著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的RNA分子(如rRNA

34、，tRNA和snRNA)并且與AGO相關(guān)的小RNA很可能也具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。,AGO蛋白在賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性地與m(7)G-帽子結(jié)合，從而協(xié)助miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。在Dicer的作用下，snoRNA GlsR17被加工為26 nt大小的miRNA(miR2)。熒光素酶(Luciferase)基因在其3‘端包含6個(gè)與miR2作用位點(diǎn)一致的序列，將該酶的mRNA與人工合成的miR2共同溫育，則導(dǎo)致熒光

35、素酶的表達(dá)量下降40%，而mRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很可能是通過翻譯阻遏而不是mRNA降解完成的。另一方面，Dicer基因的沉默則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中snoRNA不能被分解，相應(yīng)miRNA在細(xì)胞中的含量急劇降低。同時(shí)變異表面糖蛋白(Variant surface glycoprotein，VSG)表達(dá)不受限制，由單一表達(dá)變成多表達(dá)，表明調(diào)節(jié)藍(lán)氏賈第蟲的抗原變異是miRNA的沉默調(diào)節(jié)功能之一。,六、寄生蟲熱激蛋白的研

36、究進(jìn)展,定義：熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是指所有原核生物和真核生物在生長發(fā)育或受到不同理化及病理因素刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)新合成或表達(dá)量增加的一組蛋白質(zhì)家族，屬非分泌型蛋白質(zhì)。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結(jié)構(gòu)和功能最為保守的一類蛋白質(zhì)，同時(shí)也是分子伴侶（Molecular chaperone）中最重要的一類蛋白。熱激蛋白的主要生物學(xué)功能是幫助相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊（Folding）、移位（Translocation）、

37、復(fù)性（Renaturation）和降解（Degradation），以保護(hù)生物體細(xì)胞免受內(nèi)外不良因素的損害。,作用機(jī)理：熱激蛋白通常在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生，其表達(dá)非常迅速。應(yīng)激因素包括高溫、缺氧、缺血、Ca2+含量增高、癌癥和局部損傷感染等多種有害因素，這些因素引發(fā)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，使原本在正常情況下以單體形式與阻遏蛋白結(jié)合而不能結(jié)合到熱激元件（Heat shock element，HSE，即在熱激蛋白基因轉(zhuǎn)錄中起調(diào)控作用的DNA序列）上的熱激

38、因子（Heatshock factor，HSF，可識(shí)別熱激元件）受刺激而與阻遏蛋白分離，與熱激元件特異結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。,寄生蟲HSP：在寄生蟲感染宿主過程中，宿主因寄生蟲的入侵而處于應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生對(duì)蟲體入侵起保護(hù)作用的HSPs。而寄生蟲在入侵宿主的過程中，由于環(huán)境溫度和理化條件的改變，生理和免疫因素的作用，使寄生蟲蟲體也處于應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生參與寄生蟲分化、增強(qiáng)寄生蟲毒力及逃避宿主免疫作用的HSPs。多數(shù)寄生蟲的HSPs可作為免疫

39、優(yōu)勢抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體。近年來對(duì)寄生蟲HSPs的研究熱點(diǎn)主要集中在原蟲、線蟲、吸蟲等的HSP90、HSP70和HSP60上，也部分涉及sHSP。,應(yīng)用：HSPs的許多特性顯示其具有廣闊的應(yīng)用前景，如HSP70可以作為一個(gè)潛在的亞單位疫苗佐劑協(xié)同對(duì)抗瘧原蟲的感染。非完整片段的HSP70與完整片段的HSP70比較，兩者顯示相同的疫苗佐劑特性，將前者與瘧疾抗原EB200構(gòu)建成融合蛋白，用該融合蛋白免疫機(jī)體能產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1免疫應(yīng)答。同時(shí)

40、惡性瘧原蟲HSP90與植物HSPs相似、同源性高，這可能為預(yù)防、治療瘧疾提供一個(gè)極好的候選疫苗。,,,,七、寄生蟲與細(xì)胞凋亡,定義：細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細(xì)胞死亡(Programmedcell death, PCD),是不同于壞死(Necrosis)的另一種細(xì)胞死亡形式。它是由基因控制的、細(xì)胞自主的有序死亡。凋亡與組織器官的發(fā)育和機(jī)體正常生理活動(dòng)的維持密切相關(guān)。在正常情況下,機(jī)體通過凋亡清除衰老或異常的細(xì)胞,并控制細(xì)

41、胞的數(shù)量,調(diào)節(jié)組織器官的大小、形狀,以維持正常的生理平衡。過度凋亡或正常凋亡的過程被抑制,均可導(dǎo)致組織或器官發(fā)生病理改變甚至死亡。自1972年Kerr等提出凋亡的概念后,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)各學(xué)科共同關(guān)注并極為活躍的研究領(lǐng)域。,寄生蟲感染與宿主細(xì)胞凋亡,★ 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 某些寄生蟲感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡在疾病的發(fā)生機(jī)制中起著重要的作用,如引起CD4+細(xì)胞的缺失（利什曼原蟲、微小隱孢子蟲、血吸蟲、肝包蟲、絲蟲、蛔蟲等）,誘導(dǎo)宿

42、主的免疫功能低下等?！?抑制細(xì)胞凋亡剛地弓形蟲感染的細(xì)胞能抵抗多種誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡,包括Fas依賴和非依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、IL-2缺乏、γ-射線、紫外線等誘導(dǎo)的凋亡,而這種抑制活性需要活的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲和不間斷的蛋白合成。杜氏利什曼原蟲可抑制骨髓衍生的巨噬細(xì)胞凋亡,這有利于原蟲在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖。,寄生蟲的細(xì)胞凋亡,★ 弓形蟲： NO體外誘導(dǎo)速殖子凋亡★ 伯什瘧原蟲： 紅內(nèi)期蟲體自發(fā)凋亡★ 血吸蟲：N

43、O，基因組中包含細(xì)胞凋亡的基因★ 肝包蟲：H2O2誘導(dǎo)★ 錐蟲：改變體外培養(yǎng)條件、蟲體密度誘導(dǎo)凋亡,檢測方法：★ 普通光鏡檢查、熒光顯微鏡和透射電鏡檢查等形態(tài)學(xué)觀察★ DNA瓊脂糖凝膠電泳★ 檢測DNA含量的PI染色法★ 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) (TUNEL法)★ 檢測細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)活化水平★ 檢測細(xì)胞膜成份變化的Annexin V聯(lián)合PI染色法等多種流式細(xì)胞術(shù)定量分析方法,,,,