基因檢測(cè)技術(shù)的類型及臨床應(yīng)用培訓(xùn)課件

1、基因檢測(cè)技術(shù)的類型與臨床應(yīng)用,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)服務(wù)的特殊性,先證者診斷家庭成員檢測(cè)遺傳病治療遺傳咨詢遺傳病預(yù)防二級(jí)預(yù)防產(chǎn)前診斷三級(jí)預(yù)防宗旨：為家庭謀福祉,不僅關(guān)系著先證者還牽連著家庭、家族產(chǎn)前診斷一步錯(cuò)步步錯(cuò)生命所系如臨深淵、如履薄冰,遺傳病的復(fù)雜性,疾病種類繁多，~7000+種，不斷增加涉及各個(gè)臨床分科，就醫(yī)困難遺傳異質(zhì)性，精準(zhǔn)的核心難題新學(xué)科，教育準(zhǔn)備不足醫(yī)療資源分配差強(qiáng)人意共同努力,4,人類基因突變

2、分類,單堿基置換缺失和插入重復(fù)倒位拷貝數(shù)變異動(dòng)態(tài)突變基因轉(zhuǎn)換（gene conversion）復(fù)雜基因組重排：插入-缺失（Indels）甲基化異常（包括表觀遺傳學(xué)）,5,基因變異種類和大小,基因檢測(cè),,,,現(xiàn)有的遺傳檢測(cè)的技術(shù),常規(guī)檢驗(yàn)影像學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析分子細(xì)胞遺傳學(xué)FISHaCGHSNP array生化遺傳學(xué)質(zhì)譜、色譜、串聯(lián)-質(zhì)譜酶活性測(cè)定分子遺傳學(xué)基因組變異aCGHSNP

3、a單基因變異PCR-電泳PCR-雜交........測(cè)序Sanger測(cè)序NGS（下一代測(cè)序）,遺傳檢測(cè)≠測(cè)序測(cè)序≠NGS,分子遺傳檢測(cè)技術(shù),基于分子雜交Southern印跡雜交寡核苷酸探針雜交(ASO)ASO反向斑點(diǎn)雜交（RDB)SNP DNA 芯片多重連接探針擴(kuò)增(MLPA) FISH 陣列比較基因組雜交(Array CGH) BoBs基于PCR 、電泳擴(kuò)增長(zhǎng)度分析STR多態(tài)性連鎖分析動(dòng)態(tài)突變

4、多重PCRGapPCR等位基因特異性PCR（AS-PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） PCR產(chǎn)物酶切,基于構(gòu)象分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 高效液相色譜(DHPLC)多色探針熔解曲線分析（MMCA）定量分析real time PCRMLPAaCGHSNPa測(cè)序Sanger 測(cè)序NGS（二代測(cè)序）序列測(cè)定算法改進(jìn)（拷貝數(shù)）大片段缺失/重復(fù)檢測(cè)（CNV-Seq),基因檢測(cè),PCR,提示：此圖為動(dòng)畫，等

5、待“END”出現(xiàn)后再點(diǎn)擊,最簡(jiǎn)單的應(yīng)用：檢測(cè)有無,1.Marker-DL10002.正常男性對(duì)照3.正常女性對(duì)照4.空白對(duì)照5.待測(cè)標(biāo)本-M15846.待測(cè)標(biāo)本-M15947.待測(cè)標(biāo)本-M1605,DNA測(cè)序,ddATP,自動(dòng)化DNA測(cè)序,,Big Dye,自動(dòng)化測(cè)序結(jié)果,大尺度變異的檢測(cè)方法,傳統(tǒng)的染色體核型分析，檢測(cè)染色體數(shù)目和大結(jié)構(gòu)異常一般分別率：G350、G400高分辨：G500、G800原位雜交，檢測(cè)已知位置

6、的缺失或插入放射性熒光標(biāo)記（FISH）染色體特異探針區(qū)帶特異探針（包括著絲粒探針、端粒探針）基因特異探針間期核FISH染色體微缺失分析（CMA），檢測(cè)精度較高按檢測(cè)方法分比較基因組雜交（CGH）：DNA片段芯片探針（aCGH）（DNA克隆、cDNA克隆、合成探針按載體分中期染色體體芯片SNP 芯片（單核苷酸特異探針，引物延伸）（SNP array）,aCGH,Illumina (GoldeGateTM),aCG

7、H與SNPa比較,什么情況下委托CMA,國(guó)際細(xì)胞基因組芯片標(biāo)準(zhǔn)協(xié)作組(International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium，ISCAC) 2010年研究了21698例智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形以及自閉癥患者，發(fā)現(xiàn)染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA) 技術(shù)對(duì)致病性CNVs的檢出率為15-20%，比傳統(tǒng)G顯帶核型分析技術(shù)的檢

8、出率（3%）高很多。ISCAC推薦將CMA替代染色體核型技術(shù)作為對(duì)原因不明的發(fā)育遲緩、智力低下、自閉癥以及多種體征畸形患者的臨床一線檢測(cè)方法,Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement：chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with devel

9、opmental disabilities or congenital anomalies [J]. Am J Hum Genet, 2010, 86(5): 749-764.,18,外顯子缺失：多重PCR,,,南京江蘇省人民醫(yī)院生殖遺傳檢測(cè)中心,多態(tài)性分析檢測(cè)缺失,雙側(cè)雙重AS-PCR與PCR-酶切：SMN1 e7純合性缺失,母源污染的致命性差錯(cuò)！！,李曉僑 姚鳳霞 蘇亮 ，等.一種簡(jiǎn)化的檢測(cè)SMN1基因純合性缺失的方法。醫(yī)學(xué)研究雜

10、志 2009；38（5）：29-32,21,缺失區(qū)域多態(tài)性位點(diǎn)分析,Williams 綜合征,,,,,多重連接探針擴(kuò)增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA）,,,拷貝數(shù)檢測(cè),MLPA結(jié)果分析,DMD,,MLPA結(jié)果的一般顯示,直觀的結(jié)果顯示,,DMD,重復(fù)/插入(包括CNV)檢測(cè)方案,小片段PCR產(chǎn)物直接電泳（二重）PCR產(chǎn)物Sanger直接測(cè)序大片段So

11、uthern印跡實(shí)時(shí)（定量）PCR長(zhǎng)片段PCR、Gap-PCRMLPAFISH芯片aCGHSNP arrayBoBsNGSCNV-Seq序列測(cè)定數(shù)據(jù)（新算法）,重復(fù),D464: P034: e3-10dup,,P035: e11-18dup,,DMD,動(dòng)態(tài)突變,Southern印跡PCRGC-rich長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物電泳重復(fù)序列探針雜交FQ-二重PCR，電泳TP-PCR（例如重復(fù)序列特異內(nèi)引物介導(dǎo)的“多

12、頻段” PCR——AmplideX FMR1），電泳,29,Fq-PCR分析動(dòng)態(tài)突變,定量分析,,SCA3,,30,Trip—PCR：AmplideX FMR1,http://www.clinchem.org/cgi/doi/10.1373/clinchem.2009.136101,“多頻段PCR”,PWS/AS檢測(cè),15q11-13區(qū)域父源基因缺失，母源基因甲基化 PWS。,,甲基化分析（Hha I酶切）,缺失,小尺度突變的檢

13、測(cè)方法,點(diǎn)突變檢測(cè)缺失檢測(cè)重復(fù)/插入檢測(cè)動(dòng)態(tài)突變檢測(cè)倒位檢測(cè)轉(zhuǎn)換突變檢測(cè)甲基化檢測(cè),基因檢測(cè),點(diǎn)突變檢測(cè)方案,單一基因突變檢測(cè)，PCR+Sanger測(cè)序，RDB、MMCA優(yōu)先突變類型檢測(cè)優(yōu)先突變區(qū)域檢測(cè)常染色體基因突變等位基因檢測(cè)遺漏的可能錯(cuò)義或同義的致病性判斷大片段缺失引物區(qū)模板缺失引物不應(yīng)Primer-SNP未覆蓋區(qū)域啟動(dòng)子區(qū)域的突變內(nèi)含子中影響mRNA加工的突變UTR區(qū)域突變遙遠(yuǎn)調(diào)控區(qū)的突變

14、遺傳異質(zhì)性疾病主要基因分層突變檢測(cè)（同上）高通量NGS疾病組（癥狀群）多個(gè)候選基因的外顯子捕獲測(cè)序全基因組測(cè)序,積累經(jīng)驗(yàn)，隨時(shí)調(diào)整,基因檢測(cè),等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）,在嚴(yán)格的雜交洗脫溫度下，只要有一個(gè)堿基不匹配，正常探針只能與正?；蛐蛄须s交。通常為兩份，一份與正?；蛐蛄须s交，一份與突變序列雜交。通過控制洗脫溫度，使正常探針只能與正常基因雜交而不與突變序列雜交，反之亦然。,基于分子雜交,,C,,A,寡核苷酸探

15、針（ASO) 檢測(cè)PAH點(diǎn)突變,基于分子雜交,ASO反向雜交(RDB)檢測(cè)β地貧,未知突變的檢測(cè),測(cè)序Sanger：應(yīng)用于臨床診斷明確MLPA、SNParray補(bǔ)充NGS篩查：應(yīng)用于遺傳異質(zhì)性高、基因龐大Sanger測(cè)序驗(yàn)證傳遞分析,測(cè)序提示基因缺失,下一代測(cè)序（NGS）,分子生物學(xué)基因組DNA的片段化及建庫(kù)平行擴(kuò)增及測(cè)序數(shù)據(jù)拾取及組裝生物信息學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)SNV、微小缺失列表遺傳學(xué)變異的篩選傳遞分析醫(yī)學(xué)

16、遺傳學(xué)臨床解讀,二代測(cè)序,二代測(cè)序數(shù)據(jù)示意圖,基因捕獲測(cè)序結(jié)果：基因突變,突變,X染色體基因缺失/重復(fù),44,測(cè)序技術(shù)的遺漏（ADO）：捕獲不全及PCR不應(yīng),缺失的真?zhèn)蜳CR測(cè)序時(shí)，等位基因遺漏,,,,X,,X,,,,二代測(cè)序技術(shù)的評(píng)價(jià),長(zhǎng)處高通量將一本書拆開來，多人同時(shí)讀眾多基因，遺傳異質(zhì)性疾病，一攬子解決多個(gè)個(gè)體，末端標(biāo)簽（降低成本）（醫(yī)生）臨床診斷的精度要求低（市場(chǎng)宣傳的誘人之處）,短處海量信息的篩選難度捕獲不

17、全遺漏集成不完善，Panel構(gòu)成不全并不能“一網(wǎng)打盡”缺失/重復(fù)內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)域、UTR不覆蓋測(cè)序深度點(diǎn)突變的誤差（擬基因的干擾？）普及性價(jià)格解度,1.數(shù)據(jù)庫(kù)的支持2.Sanger驗(yàn)證3.冷靜選擇，謹(jǐn)慎解讀,適宜技術(shù)：不求最高，但求最準(zhǔn),強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)：遺傳異質(zhì)性,基因座異質(zhì)性：相同的臨床癥狀（疾?。┯刹煌幕蛞鸲@，有100多個(gè)基因座白內(nèi)障，有20多個(gè)基因座脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，有10多個(gè)基因座痙攣性截癱，有

18、30多個(gè)基因座高苯丙氨酸血癥型：苯丙酮尿癥（一個(gè)基因）、BH4缺乏癥（有4個(gè)基因）成骨不全，有17個(gè)亞型，15個(gè)基因座等位基因異質(zhì)性：同一基因的不同等位基因所導(dǎo)致的臨床癥狀不同。例如：珠蛋白基因,遺傳異質(zhì)性：成骨不全的致病基因,,,醫(yī)生的視野,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家的視角,醫(yī)生是實(shí)驗(yàn)室的眼睛，實(shí)驗(yàn)室是醫(yī)生的眼鏡、放大鏡、顯微鏡沒有臨床表型，實(shí)驗(yàn)室無法致病基因,遺傳異質(zhì)性：新生兒篩查：PKU（實(shí)際是HPA）,病因分類：苯丙氨酸羥化酶（

19、PAH）缺乏典型PKU：Phe≥1200?mol/L(≥20mg/dl)輕型PKU：Phe360-1200?mol/L(6-20mg/dl)HPA: Phe<360?mol/L(<6mg/dl)四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(PTPS)缺乏二氫蝶啶還原酶(DHPR)缺乏三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶(GTPCH)缺乏蝶呤-4 α -二甲醇胺脫水酶(PCD)缺乏,按對(duì)BH4反應(yīng)性分類： BH4反應(yīng)

20、型： BH4缺乏癥PAH缺乏癥BH4無反應(yīng)型PAH缺乏癥,必須鑒別診斷，事關(guān)治療與產(chǎn)前診斷,遺傳檢測(cè)的申請(qǐng),單基因病先證者診斷，盡量診斷明確單個(gè)基因突變分析對(duì)醫(yī)生要求高遺傳異質(zhì)性強(qiáng)或診斷不明確醫(yī)生可以根據(jù)病種（癥狀）下單（打包）二代測(cè)序需要Sanger驗(yàn)證要求解釋明確不要被忽悠,盡量描述臨床背景遺傳檢測(cè)為“管中窺豹”醫(yī)生指那打那聯(lián)系臨床表現(xiàn)分析檢測(cè)結(jié)果父母的檢測(cè)問題需要進(jìn)行傳遞分析避免漏檢避免錯(cuò)誤結(jié)

21、論但DMD的母親不需要檢測(cè)PWS/AS的父母不要檢測(cè)因?yàn)殡[秘傳遞的很少陰性結(jié)果可能引起誤解、誤導(dǎo),檢測(cè)項(xiàng)目選擇,有的放矢點(diǎn)突變檢測(cè)已知突變檢測(cè)Sanger測(cè)序RBDMMCA未知突變的檢測(cè)Sanger測(cè)序拷貝數(shù)檢測(cè)多重PCR（缺失）Gap-PCR（缺失）MLPA（缺失、重復(fù)）Real-time PCR動(dòng)態(tài)突變,撒大網(wǎng)CMASNPaAcghBoBaNGS外顯子較多的單一基因遺傳異質(zhì)性癥狀包

22、全外顯子,遺傳檢測(cè)的材料,外周血抗凝血血片組織塊病理組織蠟塊切片穿刺液精液毛囊絨毛膜絨毛脫落上皮細(xì)胞口腔唾液拭子尿液羊水,分子診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用,臨床擬診應(yīng)盡量準(zhǔn)確檢測(cè)方案的確定醫(yī)生是實(shí)驗(yàn)室的眼睛，實(shí)驗(yàn)室是“指哪打哪”NGS數(shù)據(jù)解讀解讀——數(shù)據(jù)與臨床表型的對(duì)接照妖鏡下妖魔盡現(xiàn)，但誰是真兇？因此，即使不能做出診斷，也要提供詳細(xì)的臨床描述檢測(cè)項(xiàng)目?jī)?yōu)先選擇簡(jiǎn)單穩(wěn)定的適宜技術(shù)，不求最好，只求準(zhǔn)確

23、選擇NGS，要注意panel覆蓋率,采用適宜檢測(cè)方案,臨床背景：患兒出生一個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)左側(cè)“腹股溝包塊”，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為“疝氣”。B超提示“左側(cè)腹股溝可疑睪丸聲像”。染色體核型分析為46,XY。NGS檢測(cè)：AR基因外顯子1檢測(cè)到缺失突變，c.512delT(p.F171fs)?；蛟\斷：不完全型雄激素不敏感（PAIS）評(píng)論：應(yīng)該根據(jù)臨床和核型分析，確定檢測(cè)方案，AR基因的Sanger測(cè)序應(yīng)為首選。,NGS,臨床背景：患兒G2P2

24、，BW3300g，足月順產(chǎn)。智力運(yùn)動(dòng)落后，10個(gè)月會(huì)坐，現(xiàn)可扶走，會(huì)叫爸爸，納可，愛吃咸食，大便干，3天排便1次。精神反應(yīng)可，咳嗽，痰多，肌力、肌張力可。MRI：雙側(cè)基底節(jié)損害。NGS結(jié)果：線粒體DNA突變：MT-ATPase6 mt.9176T>C 純質(zhì)性改變?？蓪?dǎo)致Leigh綜合征或家族性雙側(cè)紋狀體壞死 與線粒體病相關(guān)的核基因：POLGc.500delG（母源）雜合突變，可導(dǎo)致線粒體DNA缺失綜合征（AR）或進(jìn)行性眼外

25、肌麻痹（AD）評(píng)論：分步委托可避免無用功,NGS結(jié)果驗(yàn)證,解決三個(gè)問題：確定是否真實(shí)存在可能是擬基因的干擾樣品是否錯(cuò)了是否來自父母可能的是新突變顯性遺傳致病突變的確認(rèn)兩個(gè)突變可能來自同一個(gè)親人NGS的結(jié)果只是數(shù)據(jù)，驗(yàn)證之后才是個(gè)體的基因型樣品是否有錯(cuò),雜合子：[c.3230C>T,p.P1077L][c.4726C>T,p.R1576C]/,背景：耳聾和關(guān)節(jié)炎耳聾相關(guān)基因，101個(gè),基因：TRIOBP,

26、NGS的應(yīng)用需要多方面合作,分子生物學(xué)基因組DNA的片段化及建庫(kù)平行擴(kuò)增及測(cè)序數(shù)據(jù)拾取及組裝生物信息學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)遺傳學(xué)變異的篩選醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)臨床解讀,基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的挑戰(zhàn),科學(xué)問題要嚴(yán)謹(jǐn)大數(shù)據(jù)庫(kù)的搭建技術(shù)的規(guī)范化程序的規(guī)范化從營(yíng)銷到售后服務(wù)強(qiáng)調(diào)遺傳咨詢科研要跟上技術(shù)的研發(fā)結(jié)果的臨床意義NGS檢出的AD、XR致病基因與臨床表型不吻合所引起的思考倫理學(xué)問題要慎重“能”與“該”對(duì)生命的敬畏隱私

27、報(bào)告的投送匿名化：數(shù)據(jù)庫(kù)和檢測(cè)報(bào)告第三方檢測(cè)中服務(wù)的提供公平競(jìng)爭(zhēng)行業(yè)行為規(guī)范化,沒有一項(xiàng)技術(shù)是完美的,染色體、aCGH的分辨率大數(shù)據(jù)解讀缺乏判斷依據(jù)點(diǎn)突變致病性的判斷，HGMD或dbSNP的不足覆蓋度參數(shù)的考量捕獲不全，無論是Sanger還是NGSPrimer-SNP大片段缺失群體差異，數(shù)據(jù)使用，中國(guó)人數(shù)據(jù)缺乏個(gè)體差異，NIPT假陰性點(diǎn)與線，管中窺豹，可能有遺漏評(píng)價(jià)的技術(shù)上的困難檢材質(zhì)量代表性（人體

28、是一個(gè)嵌合體）,未來應(yīng)用的趨勢(shì)與挑戰(zhàn),攜帶者篩查，防患于未然游離核酸分析腫瘤早期診斷無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、診斷單細(xì)胞分析自然妊娠，母血中胎兒細(xì)胞：無創(chuàng)產(chǎn)前診斷IVF，胚胎細(xì)胞：PGT、PGD大跨度分析單分子測(cè)序單染色體測(cè)序長(zhǎng)片段PCR、純化（克隆測(cè)序）,基因突變的描述,以c、g、r、m、p、等5個(gè)小寫英語(yǔ)字母和縮略號(hào)‘.’指出是在哪種層面上描述的變異“c.” ：編碼DNA序列（coding DNA sequence）“g

29、.” ：基因組DNA（genomic DNA），以RefSeq為準(zhǔn)“m.” ：線粒體DNA（mitochondrial DNA），已有編號(hào)“r.”： RNA，同c.“p.”：蛋白質(zhì)（protein），以第一個(gè)密碼子（甲硫氨酸）為1C.編號(hào)始密碼子ATG中的A編號(hào)為‘1’ 5’UTR：‘-1’，‘-2’，… ；3’UTR：*1、*2，…；內(nèi)含子5’端：外顯子最后1個(gè)核苷酸的編號(hào)‘+1’、‘+2’，…內(nèi)含子3’端：外顯子最

30、后1個(gè)核苷酸的編號(hào)‘-1’、‘-2’，…,http://www.hgvs.org/mutnomen,變異類型的描述,DNA水平：①單核苷酸置換：以‘﹥’表示置換，之前為被置換的核苷酸，之后為置換后的核苷酸，分別以大寫英語(yǔ)字母A、T、G、C表示，如，G>T；② 缺失、插入、重復(fù)、轉(zhuǎn)換缺失：‘del’ （deletion）重復(fù)：‘dup’ （duplication）插入：‘ins’（insertion）倒位：‘inv’ （