hpv檢測技術及臨床應用

1、HPV檢測技術及臨床應用,內容,HPV檢測技術的誕生背景HPV檢測臨床應用的進展HPV檢測主要的技術及特點碩世21HPV分型定量檢測的優(yōu)勢,HPV與宮頸癌關系的確立,Professor Harald zur HausenNobel Prize for Medicine 2008,1976年：Harald zur Hausen在宮頸癌及疣體患者中發(fā)現(xiàn)了HPV DNA；1984年：Harald zur Hausen從宮頸癌患者中克

2、隆了HPV16型和18型病毒。,“The first one who demonstrated HPV-DNA sequences in cervical cancer biopsies and cervical cancer cell lines.”,Cytology Reduced Cervical Cancer Incidence but Unmet Need Still Exists,http://seer.cancer.go

3、v/archive/csr/1975_2010/results_merged/sect_05_cervix_uteri.pdf: SEER 9 Incidence & U.S. Mortality 1975-2010, All Races, Females. Rates are Age-Adjusted. (accessed 3/25/14),細胞學減少了宮頸癌的發(fā)生率，但尚未滿足的需求依然存在,,對于CIN2及以上病變檢測的敏

4、感性，細胞學低于HPV DNA檢測1精確性差：不同的細胞病理學醫(yī)生之間或實驗室之間對結果的判讀，存在高度的變異2只能分辨已經處于癌或癌前病變的婦女，不能分辨具備發(fā)展為癌前病變的風險婦女,Castle PE, et al. Lancet Oncol 2011; 12:880–890 plus supplementary tables.Wright TC et al. Int J Cancer. 2013 Oct 7. doi: 10

5、.1002/ijc.28514. [Epub ahead of print],單獨使用細胞學的局限性,細胞學假陰性率高女性確診為浸潤癌（ICC）的篩查史,1. Leyden WA, et al. J Natl Cancer Inst 2005; 97:675?683; 2. Andrae B, et al. J Natl Cancer Inst 2008; 100:622?629.,細胞學臨床敏感性明顯更低于HPV DNA檢測,Wh

6、itlock EP, et al. Ann Intern Med. 2011; 155:687?697, W214?5.,Studies performed in developed countries in women 30 years and older.,,,,,,,,,,,,,平均增加了35.7%,,≥CIN2的檢測敏感性 (%),細胞學缺乏精確性細胞學的判讀重復性差,質控（ QC ）評審診斷重讀了4948份液基細胞學片子

7、,原始診斷結果,Re-read of 4948 Liquid-based Cytology SlidesStoler M and Schiffman M, JAMA. 2001;285:1500-1505,,ASC-US和HSIL 的結果判讀一致性最差,,* For ≥CIN2Wright et al. Int. J. Cancer, 2014; 134(8):1835-43,,,,ATHENA 臨床研究: 細胞學在各實驗室間檢測

8、的變異很大,Khan et al. J Natl Cancer Inst. 2005; 97:1072-1079.,隨訪月數(shù),發(fā)展為≥CIN3的百分比,≥30歲，細胞學為NILM，10年≥CIN3的累計風險,,13,229 women aged ≥30 years, according to oncogenic HPV status at enrollment,細胞學不能像HPV DNA檢測那樣，可預測風險HPV DNA檢測確定了婦

9、女隨著時間CIN3以上病變的發(fā)展風險,內容,HPV檢測技術的誕生背景HPV檢測臨床應用的進展HPV檢測主要的技術及特點碩世21HPV分型定量檢測的優(yōu)勢,,,1970s豪森提出HPV感染與宮頸癌有關,美國宮頸癌死亡人數(shù)下降85%1941年，死亡26000人2010年，死亡4210人。,宮頸癌篩查重大進展時間表,1. HPV聯(lián)合細胞學篩查（2012年ASCCP/ACS/ASCP）,Saslow D, Solomon D, Law

10、son HW et al. Am J Clin Pathol. 2012 Apr;137(4):516-42.,HPV檢測聯(lián)合細胞學篩查（30歲及以上）,ASCCP，American Society for Colposcopy and Cervical Pathology：美國陰道鏡和宮頸病理學會CSCCP，China Society for Colposcopy and Cervical Pathology：中國陰道鏡和宮頸病理學

11、會LSIL，Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion)：低度鱗狀上皮內病變,Saslow D et al, Journal of Lower Genital Tract Disease, 2012,HPV檢測+細胞學,細胞學≥ LSIL,HPV+ & NILM,HPV- & ASC-US,HPV- & NILM,HPV+ & ASC-US,陰道鏡,間隔5年篩查,

12、ASCCP推薦：間隔3年篩查CSCCP推薦：間隔1年篩查,HPV16/18+,HPV16/18-,HPV16/18分型 立即,重復聯(lián)合檢測間隔12個月,HPV+ 或≥ ASC,HPV- & NILM,陰道鏡,間隔3年篩查,重復聯(lián)合檢測間隔12個月,2. 21歲及以上女性細胞學ASC-US的分流管理 (2013年ASCCP指南推薦),意義不明的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）,陰性,≥ASC,常規(guī)篩查（3年內細胞學檢

13、查）,陰道鏡 不充分陰道鏡檢查未觀察到上皮病變，首選頸管取樣 充分陰道鏡檢查轉化區(qū)有上皮病變，可接受頸管取樣,HPV陽性,HPV陰性,重復聯(lián)合檢測間隔 3年,參照ASCCP指南管理,重復細胞學，間隔 1年（可接受）,HPV檢測（首選）,L. Stewart Massad, et al, Journal of Lower Genital Tract Disease, 2013.,3. 25歲及以上女性HPV檢測宮頸癌一線初篩 (

14、2016年ACOG指南推薦),ACOG，American Congress of Obstetricians and Gynecologists：美國婦產科醫(yī)師學會NILM，negative for intraepithelial lesion or malignancy：未見上皮內病變或惡性病變ASC-US，Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance：意義不明的非典型鱗

15、狀上皮細胞,2016 ACOG practice bulletin，Number 157.,HPV 檢測預防宮頸癌（歐洲試驗結果）,4 個歐洲隨機試驗，分別在瑞典、荷蘭、英國和意大利進行包括 176,464位20-64歲婦女隨訪的中位年數(shù)為6.5 (1,214,415 人-年)HPV 初篩相比細胞學，減少了宮頸癌的發(fā)生率,Ronco et al. Lancet，2014,HPV檢測篩查宮頸癌的預防效果優(yōu)于細胞學,Ronco e

16、t al. Lancet，2014,匯總四個隨機對照試驗的宮頸癌發(fā)病率：細胞學（對照組）與HPV檢測（試驗組）,美國ATHENA研究,研究人群：美國46,887位接受常規(guī)篩查的婦女 (其中32,260位 >30 歲，41955位 >25 歲)受檢者同時婦科檢查，液基細胞學檢查，HPV檢測和基因分型所有HPV (+) 和/或 細胞學 (+)；和選取部分HPV (-) / NILM（未見上皮內細胞病變）的人群行陰道鏡檢查,

17、比較不同篩查策略效能（25歲及以上女性）,,,,權衡CIN3+的檢出率和陰道鏡轉診率,Wright et al. Gynecol Oncol 2015,*混合策略是指25-30歲細胞學篩查策略結合30歲及以上HPV檢測聯(lián)合細胞學篩查策略,宮頸癌發(fā)生率（每100,000）,年齡組,* http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/,,SEER 腫瘤登記(1975-2010)*,美國宮頸癌的發(fā)病率25 – 3

18、4 歲時快速上升期,SEER（Surveillance, Epidemiology, and End Results ）,Presented to FDA panel, 12 March 2014,Age Group,40%,30%,20%,10%,0%,25-29,40-49,30-39,>50,≥CIN3病例（%）,21-24,28%,17%,10%,37%,8%,,25%,N=22,006Women,N=6647Wom

19、en,28% 的≥CIN3 病例發(fā)生在25-29 歲年齡段,42.7,53.3,61.7,72.2,細胞學漏檢了25-29年齡段的大多數(shù) ≥CIN3病例,Percentages shown are for hrHPV+ women with ≥CIN3, N=252Huh W, et al. 27th International Papillomavirus Conference, Berlin, Germany, September

20、 17–22, 2011, OP-229.,比率≥CIN3 (%),年齡,,4. 宮頸病變術后的追蹤與管理,2013年ASCCP指南推薦的CIN2, 3 管理*,*如果妊娠或年齡在21–24 歲的女性，管理選擇可能會有所差異,術前、術后的檢測提示病灶是否清除干凈術后 6、12 個月復查HPV檢測，若結果仍為陽性，提示有殘留病灶或復發(fā)可能CIN 轉歸的預測，若 CIN 不伴HPV ，預示良性轉歸,5. HPV分型及定量檢測的臨床

21、應用,預測病變的發(fā)展或轉歸對于非CIN的HPV檢測陽性患者，根據(jù)病毒型別及載量的變化，監(jiān)測患者HPV是自限性感染（一過性感染）或持續(xù)性感染，預測患者病變的發(fā)展或轉歸風險提示高病毒載量預示著患者自我消退的時間更長以及潛在的病變風險更高，提示臨床需進行更為積極的管理指導疫苗的使用和研究2006年FDA批準了第一代四價抗HPV疫苗（抗HPV16、18、6、11），2014年FDA又批準了9價抗HPV疫苗（抗HPV16、18

22、、31、33、45、52 、 58 、6、11），推薦對已有性生活的人群，在接種疫苗前進行HPV基因分型檢測,Shen G, Chen J, Wang Y, et al, 2014. Jonas Lefevre,Catherine Hankins ,et al. 2004. 廖秦平, 趙健, 2010.,病毒載量是宮頸病變發(fā)生發(fā)展的關鍵因素,隨著HPV病毒載量的增加，細胞異常的比例顯著增加,Bigras G, Marval F D

23、. British Journal of Cancer, 2005, 93(5):575-81.,病毒載量越高，持續(xù)感染的時間越長,病毒載量可預測病毒的清除或疾病的進展,Trevisan A, Schlecht N F, Ramanakumar A V, et al. Journal of General Virology, 2013, 94(Pt 8):1850-1857.,三種不同的檢測試劑，評估不同三個區(qū)隔每單位細胞內HPV16型

24、拷貝數(shù)隨時間的清除情況,喬友林團隊載量預測風險的研究,,,結論：HR HPV病毒載量越高，發(fā)生宮頸癌及高度病變的風險越高，提高病毒載量界值可以進一步分流HPV陽性人群，從而更合理的分配衛(wèi)生資源。,Kang L, Zhao F, Chen F, et al. [Value of high risk human papillomavirus viral load in predicting cervical lesions and tria

25、ging for high risk (HR)-HPV-positive women].[J]. Zhonghua zhong liu za zhi [Chinese journal of oncology], 2014, 36(4):316-20.,內容,HPV檢測技術的誕生背景HPV檢測臨床應用的進展HPV檢測主要的技術及進展碩世21HPV分型定量檢測的優(yōu)勢,國內主要HPV檢測產品,非核酸信號放大法,digene HC2 HP

26、V檢測：檢測13種高危型，不分型,德國凱杰,careHPV檢測：檢測14種高危型，不分型,DH2 ：檢測14種高危型，不分型 DH3 ：檢測16/18型+12高危型不分型,雜交捕獲法,酶切信號放大法,Cervista HR ：檢測14種高危型，分組但不分型 Cervista 16/18 ：檢測16&18分型,DNA裂解成為單鏈,HC2全長8000堿基對的RNA探針與DNA雜交,一抗捕獲固定DNA:RNA雜交體,酶催化底物化學

27、發(fā)光，基因信號放大儀器檢測發(fā)光信號,HC2（Hybrid Capture 2）雜交捕獲二代技術,攜帶堿性磷酸酶的二抗與固定的雜交體結合,利用基因雜交、化學發(fā)光、信號放大的原理，13種高危型HPV（不分型，半定量）,核酸信號放大法,Aptima HR &Aptima 16、18/45,15高危分型,15高危不分型,16/18分型+13不分型,凱普的21HPV分型檢測（PCR+膜雜交法，定性檢測）,cobas x 480全自動核酸分

28、離純化儀,cobas z 480聚合酶鏈反應儀,日常維護2-7分鐘（手工）,樣本制備62-149分鐘,轉換到z4802-3分鐘（手工）,DNA擴增和檢測86-120分鐘,卸載z480中的反應板1分鐘（手工）,樣品加載到x48011-27分鐘（手工）,,檢測96樣本約需5小時，其中手工用時需約40分鐘,基于LightCycle480實時熒光PCR技術四個熒光信號檢測通道，分別檢測：內質控（Intern control）、HP

29、V16型、HPV18型和12高危型HPV,采用磁珠分離技術分離核酸原始收集管可直接上樣，但樣本加載需要人工操作，特別是加載液基細胞學樣本時需要手工開蓋所用耗材（槍頭、微孔板等）必須額外購買cobas4800專用耗材,cobas4800 檢測原理及流程,cobas HPV檢測,1次檢測可在4個通道內分別報告HPV16型，HPV18型，其他12種高?；旌闲图皟荣|控β-globin的結果,Wright TC Jr, et al. Am J

30、 Obstet Gynecol 2012; 206:46.e1-.e11,1、磁珠提取mRNA,2、TMA，轉錄介導的擴增,3、雜交保護及化學發(fā)光檢測（DKA）,T(胸腺嘧啶）構成的核苷酸鏈固定于磁珠上,寡核苷酸序列捕獲目標RNA,APTIMA HPV檢測（TMA技術，定性檢測）,精準醫(yī)學：HPV檢測的應用進展,雜交捕獲技術檢測13 種高危HPV不分型半定量,熒光PCR技術檢測14種高危HPV16/18分型定性,轉錄介導擴增

31、 （TMA）檢測14種高危HPV16,18/45分型定性,熒光PCR技術檢測18種高中危+3種低危型21種HPV分型 &標準化定量,不分型»分型 & 定性»定量,內容,HPV檢測技術的誕生背景HPV檢測臨床應用的進展HPV檢測主要的技術及進展碩世21HPV分型定量檢測的優(yōu)勢,碩世21HPV分型定量檢測系統(tǒng)簡介,采用獨有專利的“宮頸脫落細胞取樣處理標準化”技術和先進的多重熒光PCR

32、定量技術，可在2.5小時內快速、準確地區(qū)分樣本中的21種HPV亞型，包括13種高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5種中危型HPV26、53、66、73、82和3種低危型HPV6、11、81；并同步對21種HPV各亞型進行標準化定量。,創(chuàng)新與突破1：分管分型,定量參考基因檢測,分管區(qū)分21種HPV基因亞型,中國醫(yī)科大學附屬盛京院研究數(shù)據(jù),,碩世HPV檢測與型別鑒定的金標準測序法比較，

33、準確性99.6%,碩世HPV檢測（BMRT）的篩查性能：北京大學深圳醫(yī)院臨床研究數(shù)據(jù),Chen Q, Du H, Zhang R, et al. Genetics and molecular research: GMR, 2016, 15(2).,自采樣的檢測，碩世21HPV分型定量檢測（BMRT）敏感性高于cobas HPV檢測,,,,,全面檢測CFDA要求檢測的18種高危型,2015年CFDA頒布最新HPV試劑指導原則,http:/

34、/www.sfda.gov.cn/WS01/CL0087/136485.html,原文：依據(jù)WHO國際癌癥研究機構（IARC）及其他國際組織的研究成果，本指導原則建議將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82等5種基因型列為中等風險型別。,兩種方法HPV檢測型別的比較,碩世21HPV分型定量檢測18高中危型與CFDA最新要求完全一致,,準確

35、區(qū)分中國人群常見致病型別,*全球HPV信息中心（ICO）最新發(fā)布，鏈接網(wǎng)址：http://www.hpvcentre.net/index.php,WHO/ICO HPV相關統(tǒng)計: 宮頸癌前病變排名前10位HPV型別的分布*,,,北京大學深圳醫(yī)院臨床數(shù)據(jù),研究檢出頻率位于前四位的亞型是HPV 16、52、58、33,*研究選用的HPV檢測方法為：碩世21HPV分型定量檢測,Prof. Wu ’s Data,準確分型，風險分層,2%,0%

36、,,癌前病變風險,,陰道鏡閾值,10%,30%,Nicolas Wentzensen， 2015,創(chuàng)新與突破2：標準化定量,宮頸脫落細胞,HPV病毒,,,專利號：ZL 201110087602.1,碩世21HPV分型定量檢測是首個、唯一采用標準化定量的HPV分型檢測,中國醫(yī)科大學附屬盛京院研究數(shù)據(jù),313例HPV16陽性病例，隨著病變等級提高載量也相應增加,Sun Z et al. Bmc Cancer, 2015.,北京大學深圳醫(yī)院臨

37、床驗證數(shù)據(jù),碩世21HPV分型定量檢測：不同程度宮頸病變病灶中HPV亞型病毒載量,,HPV 16,HPV 52,HPV 58,Prof. Wu ‘s Data,北京大學深圳醫(yī)院臨床驗證數(shù)據(jù),碩世21HPV分型定量檢測：不同程度病變病灶組織中病毒載量,Prof. Wu ‘s Data,碩世21HPV分型定量報告單,,,HPV風險分層列表,,HPV陽性亞型,,每10000個細胞數(shù)量中的病毒載量，對應顯示為：6.82×107拷貝