基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用

1、基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用,府偉靈西南醫(yī)院檢驗(yàn)科,2,一.概述,隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的逐步實(shí)施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得到測(cè)定。在GenBank數(shù)據(jù)庫中已含有300萬個(gè)序列，總數(shù)超過22億個(gè)堿基對(duì)，其中包括19種不同生物體的完整序列、近9 000個(gè)已知功能或已推測(cè)功能的人類基因序列。基因序列數(shù)據(jù)庫正在以前所未有的速度迅速增長。,3,然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生

2、物信息及其在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能，成為生命科學(xué)工作者的共同課題。,4,已建立的諸如Northern印跡、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、S1核酸酶分析、噬斑雜交以及狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有效地利用新的基因組學(xué)的資源。為此，必須發(fā)展高通量或平行監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的新方法。基因芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生。,5,早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對(duì)人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查。,但直到1994 年P(guān)ea

3、se等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作技術(shù)問世之后，才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)。,因此可以說光導(dǎo)ODTA化學(xué)合成法，為基因芯片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。,7,現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國的Affymetrix公司為代表。,圖片來自益來基因網(wǎng): http://www.el-gene.com/,美國“Fortune”雜志在1997年3月對(duì)基因芯片技術(shù)

4、未來產(chǎn)業(yè)化的前景進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。,8,二.基因芯片的定義,又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。,9,三.基因芯片相關(guān)技術(shù)及其進(jìn)展,基因芯片制備技術(shù)靶基因的制備雜交和檢測(cè),基因芯片設(shè)計(jì)雜交圖像分析……,1

5、0,11,1.基因芯片的主要類型,基因芯片視分類方法不同可分為不同類型,12,基因芯片的主要類型及其簡要特點(diǎn),13,2.基因芯片的制備,基因芯片的實(shí)質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列制造基因芯片首先要解決的技術(shù)問題就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針,14,原位合成直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針合成點(diǎn)樣將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上,基因芯片制備的兩種基本方法,原位光刻合成,由美國Affymetrix公司開發(fā),16,把玻

6、璃基片上的活性羥基修飾上光保護(hù)基團(tuán)，此光保護(hù)基團(tuán)可被一定波長的光激活并脫保護(hù)。根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計(jì)光刻掩膜。將掩膜（M1）覆蓋在修飾過的基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片表面脫除保護(hù)基團(tuán)而形成活性羥基（1-2）。,步驟,引入5`端被X基團(tuán)保護(hù)、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使dNTP的3`端與基片上的活性羥基縮合，洗去未有效結(jié)合的dNTP（3）。更換掩膜M2，重復(fù)1-2，直到所需要的探針陣列合成完畢（4-6）。,,使用多種掩

7、蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含ｎ個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。,例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536（即216）個(gè)探針。,Picture From BROWN LAB http://cmgm.stanford.edu/pbrown/,原位噴印合成,芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有

8、多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。,采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學(xué)試劑。,Picture from BioDot: http://www.biodot.com,分子印章多次壓印合成法,根據(jù)所需微陣列，設(shè)計(jì)有凹凸的微印章，然后根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)在制備的各級(jí)印章上涂上對(duì)應(yīng)的單核苷酸。,按照設(shè)計(jì)的順序?qū)⒉煌奈⒂≌轮饌€(gè)依次壓印在同一基片上，得到256×256陣列的高密度基因芯片。,,圖片來自益

9、來基因網(wǎng): http://www.el-gene.com/,,256*256分子印章陣列顯微圖 （0.18%),高密度芯片DNA陣列顯微圖（0.16%）,高密度芯片DNA陣列熒光雜交圖（0.09%）,圖片來自益來基因網(wǎng): http://www.el-gene.com/,分子印章多次壓印合成法點(diǎn)樣機(jī),采用了平面微細(xì)加工技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降低單個(gè)芯片的成本可組裝大量的（104--106種）生物分子探針，獲取

10、信息量大，效率高，特別適合于基因信息的采集。結(jié)合微機(jī)械技術(shù)（MEMS），可把生物樣品的預(yù)處理，基因物質(zhì)的提取，擴(kuò)增，以及雜交后的信息檢測(cè)相集成，制備成微物芯片。,優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn),高密度——分辨率高準(zhǔn)確性——合成產(chǎn)率高一致性——工藝最優(yōu)化批量化——平面印刷法,合成點(diǎn)樣,合成點(diǎn)樣技術(shù)在基因芯片尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段時(shí)是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。隨著原位合成技術(shù)缺點(diǎn)的暴露和自動(dòng)化技術(shù)的進(jìn)步，合成點(diǎn)樣技術(shù)又重現(xiàn)生機(jī)

11、。,是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。目前，除Affymetrix等研究和生產(chǎn)基因芯片的少數(shù)大公司使用原位合成外，其他中小型公司和實(shí)驗(yàn)室研究中仍然普遍采用合成點(diǎn)樣法。,微型機(jī)械點(diǎn)樣法,化學(xué)噴射法,＋,微型機(jī)械點(diǎn)樣法,該技術(shù)由Shalon和Brown于1995年發(fā)展起來的另一類具有生命力的基因芯片制備技術(shù)。美國Synteni公司最終發(fā)展出商品儀器，完成其商品化。,通過毛細(xì)作用使用點(diǎn)樣針將生

12、化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面（點(diǎn)樣針與基底表面接觸）。第一輪結(jié)束后，清洗點(diǎn)樣針進(jìn)行下一輪操作。機(jī)器人控制系統(tǒng)可使其實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)。,方法與步驟,化學(xué)噴射法,此種方法先進(jìn)之處在于采用了壓電和其他推動(dòng)方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移生化成分。該技術(shù)正由Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA, USA)和Protogene (Palo Alto, CA, USA)等幾處中心進(jìn)行發(fā)展。,用與壓電接口（方型）相連

13、的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電流控制使樣品體積得到精確控制。第一輪結(jié)束后，清洗噴嘴進(jìn)行下一步。,方法與步驟,30,芯片制作工藝的進(jìn)展,1980年Bains等將預(yù)先合成的短DNA片段固定在固相支持物上進(jìn)行的雜交測(cè)序?qū)嶒?yàn)是基因芯片的最原始模型，所以合成點(diǎn)樣是基因芯片制作的最原始的方法由Affymetrix公司發(fā)展起來的光導(dǎo)ODTA合成照相平板印刷術(shù)將基因芯片引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階段。,31,將樣品處理、芯片雜交和信號(hào)檢測(cè)集于一體的所

14、謂“縮微實(shí)驗(yàn)室”逐漸成為基因芯片發(fā)展的新趨勢(shì)。在這方面主要有以下技術(shù)較為成功：,電子芯片三維芯片,流過式芯片石英諧振芯片,32,電子芯片,片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成1mm2的陣列，每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過氮化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將鏈連有親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下預(yù)先合成的生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。,Picture from Nanogne website: http:/

15、/www.nanogene.com/,最早由美國Nanogen公司開發(fā)，目前國內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開發(fā)這一技術(shù)。,最大特點(diǎn)：雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。最大不足：芯片制備復(fù)雜、成本較高。,三維芯片,片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用DNA分析。先把已知化合物加在凝膠條上，用3cm長的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。,35,凝膠條的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性?？梢栽谛酒贤瑫r(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與

16、檢測(cè)。是該技術(shù)不僅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯片。,美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學(xué)研究所合作開發(fā)。,應(yīng)用優(yōu)勢(shì),36,流過式芯片,在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預(yù)先設(shè)計(jì)及合成的特定寡核苷酸探針結(jié)合于芯片上微通道內(nèi)的特定區(qū)域。,Picutre from UKMSTS Suimmit Conference:http://www.cmf.rl.ac.uk/pre

17、sentations/,37,從待測(cè)樣品中分離DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記。將標(biāo)記的靶核酸樣品流過芯片，固定在芯片上微通道內(nèi)的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的靶核酸。,Picutre from UKMSTS Suimmit Conference:http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/,38,特點(diǎn)敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化。速度快，微通道加速了雜交

18、反應(yīng)，減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間。價(jià)格降低，由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡核苷酸吸咐于微通道內(nèi)，使每一種流過式芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。,Gene Logic 正在開發(fā) http://www.genelogic.com,39,3.靶基因樣品的制備,靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記。靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對(duì)象（如mRNA、DNA等）而決定。,40,3.1

19、 靶基因的制備,核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳統(tǒng)的化學(xué)提取法比較費(fèi)時(shí)，不能滿足基因芯片對(duì)快速高效的要求。因而，人們發(fā)明了與芯片相結(jié)合的核酸提取方法。芯片微過濾法生物電子芯片法,41,賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組針對(duì)人白細(xì)胞的分離設(shè)計(jì)的一種核酸樣品制備方法。微過濾芯片是通過在硅片上刻出幾個(gè)微米大小的各種形狀的過濾微通道，再在硅芯片上加上一塊玻璃蓋片而成。 發(fā)展經(jīng)歷了豎式Z型結(jié)構(gòu)、豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)到最終的橫壩式結(jié)構(gòu)。,芯片微過

20、濾法,42,為了把不同的癌細(xì)胞、細(xì)菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品中分離而設(shè)計(jì)的用作介電電泳的細(xì)胞分離方法。,通過在硅芯片上制作一系列各種排列的金屬電極和在這些電極上施加高頻電場(chǎng)，使不同的細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極。偶電極的出現(xiàn)反過來使細(xì)胞承受正介電力或負(fù)介電力，從而使細(xì)胞從各種液體樣品中分離出來。,生物電子芯片法,Picture from Nanogen website: http://wwww.nanogen.com,美國的Nanogen

21、公司通過在微過濾芯片的電極上施加一系列高壓脈沖對(duì)電極上分離得到的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行電子胞解，獲得了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的各種RNA和DNA。,Picture from Nanogen website: http://wwww.nanogen.com,44,3.2 靶基因的擴(kuò)增與標(biāo)記,主要采用熒光分子標(biāo)記：常規(guī)標(biāo)記——在擴(kuò)增過程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記）。末端標(biāo)記——直接在引物上標(biāo)記熒光。,45,4.靶基因的雜交

22、及其信號(hào)檢測(cè),熒光顯影法質(zhì)譜法化學(xué)發(fā)光法光導(dǎo)纖維法壓電石英諧振法……,46,4.1 熒光顯影法,用熒光素標(biāo)記擴(kuò)增后的待測(cè)核酸樣品，將熒光素標(biāo)記的待測(cè)核酸樣品與芯片進(jìn)行雜交，再洗去未雜交的標(biāo)記樣品，然后用熒光顯微鏡或熒光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描以采集每點(diǎn)的熒光強(qiáng)度并用電腦進(jìn)行分析比較。,47,激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng),目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。,芯片倒扣在盛有待檢核酸的儲(chǔ)液器上，芯片的探針與液面相接觸并進(jìn)行雜交反應(yīng)，能與靶核酸互補(bǔ)

23、的探針對(duì)標(biāo)記有熒光素的待檢核酸起捕獲作用。當(dāng)激光從芯片的背面聚焦于芯片與靶DNA的接觸面時(shí)，與待檢核酸雜交了的位點(diǎn)就被激發(fā)熒光，熒光信號(hào)經(jīng)棱鏡后聚焦于空間共聚焦小孔，并通過小孔而被檢測(cè)器捕獲。,48,雖然激光同時(shí)也會(huì)激發(fā)儲(chǔ)液器里未與芯片雜交的標(biāo)記靶核酸，但由于它們不在共聚焦小孔的焦平面，故這種熒光被小孔阻擋而不能到達(dá)檢測(cè)器。應(yīng)用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)在數(shù)分鐘內(nèi)即可得到一個(gè)二維的雜交模式，通過改變溫度還可以得到雜交的熱動(dòng)力學(xué)信息。,4

24、9,熱力學(xué)穩(wěn)定性完全正常的 Watson-Crick配對(duì)雙鏈 > 錯(cuò)配堿基的雙鏈熒光強(qiáng)度完全正常的 Watson-Crick配對(duì)雙鏈 > 錯(cuò)配堿基的雙鏈（5-35%）,50,熒光掃描儀簡介,電荷偶合裝置CCD（charge-coupled devices）光電倍增管PMT（photomultiplier tube）,51,圖片來自益來基因網(wǎng): http://www.el-gene.com/,CCD成像技術(shù)：主要用

25、于中、高密度基因芯片的檢測(cè),52,商業(yè)化掃描儀公司,Genomic Solutions公司Packard公司GSI公司Beecher Instruments公司Molecular DynamicsGenetic Microsystems公司Axon Instruments公司……,53,4.2 化學(xué)發(fā)光法,化學(xué)發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標(biāo)記物不是熒光素而是魯米諾之類具有化學(xué)發(fā)光特性的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光比熒光法的靈敏度更高

26、。,54,4.3 光導(dǎo)纖維法,將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直徑200μm的光纖末端，然后固定有不同探針的光纖按特定位置組合成束，形成一個(gè)微陣列的傳感裝置即光纖DNA生物傳感器微陣列。其探針末端可以伸入樣品溶液中，雜交的熒光信號(hào)由光纖另一端偶聯(lián)的CCD相機(jī)接受。整個(gè)分析操作可在5分鐘內(nèi)完成。,55,4.4 光導(dǎo)纖維法,光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以再生使用，因而成本得以降低。這種將傳感器與微陣列結(jié)合起來的方法特

27、別適用于操作雜交分析不方便的環(huán)境和不具備激光共聚焦顯微鏡這種昂貴設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室（如臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室），對(duì)推廣基因芯片的應(yīng)用有重要意義。,56,4.5 壓電石英諧振法,傳感裝置采用壓電石英諧振晶體目前正在開發(fā)之中,57,4.6 壓電石英諧振法,石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖DNA生物傳感器微陣列更具優(yōu)越性,石英諧振傳感器具有微天平之稱，敏感性很高（理論上可達(dá)到fg級(jí)水平），有望省略雜交前的擴(kuò)增步驟。石英諧振傳感器的響應(yīng)機(jī)制是“壓電效

28、應(yīng)”，即對(duì)質(zhì)量敏感，所以無須對(duì)探針或靶核酸進(jìn)行標(biāo)記。,58,四.基因芯片的臨床應(yīng)用,1998年底美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)將基因芯片列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一,59,1.核酸序列分析,雜交測(cè)序技術(shù)（SBH）鄰堆雜交技術(shù)（CSH）毛細(xì)管電泳芯片測(cè)序技術(shù),60,1.1 雜交測(cè)序技術(shù),基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。任何線性DNA或RNA單鏈均可分解為一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落重疊的寡核苷酸片段（ODT），或稱為亞序列（subsequence）

29、,將所有n體亞序列探針都固定在一個(gè)固相支持物上，n體亞序列探針的序列與其在固相支持物上的位點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)形成探針陣列。被標(biāo)記的靶序列與芯片進(jìn)行雜交后，芯片上所有雜交信號(hào)的位點(diǎn)組成一個(gè)“雜交模式”，該“雜交模式”實(shí)際上反應(yīng)的是靶序列的所有n體亞序列信息，計(jì)算機(jī)通過對(duì)該“雜交模式”的分析就可以確定靶核酸的序列。,方法與步驟,62,采用SBH技術(shù)，用含65,536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列，可測(cè)定200bp長DNA序列，采用67,108,864個(gè)1

30、3聚寡核苷酸探針的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長的DNA測(cè)序。,63,1.2 鄰堆雜交技術(shù),SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。 CSH技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長的DNA測(cè)序。,64,CSH雜交測(cè)序原理示意圖（點(diǎn)擊此處觀看Flash動(dòng)畫）,65,1.3 毛細(xì)管

31、電泳芯片測(cè)序技術(shù),Mathies等成功地應(yīng)用通過光刻加工出的毛細(xì)管長3.5厘米、橫切面50微米×8微米的毛細(xì)管電泳測(cè)序芯片在10分鐘內(nèi)完成了含433堿基對(duì)的DNA序列測(cè)定。美國的CuraGen公司和普林斯頓大學(xué)也正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。,66,2. 基因表達(dá)分析,隨著人類基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，基因組研究的重心轉(zhuǎn)了功能基因組學(xué)，研究基因的功能，特別是研究疾病相關(guān)基因已成了生物科技界的熱點(diǎn)。基因表達(dá)芯片為此提供了最好的技

32、術(shù)平臺(tái)。,67,對(duì)大多數(shù)基因而言，mRNA表達(dá)水平與其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)。,Picture from IIR: http://www.inet.uni2.dk/~iirrh/IIRhome.htm,68,一般以O(shè)ligo-dT作引物進(jìn)行RT-PCR制備靶基因，對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，從而了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)。基因芯片技術(shù)可清楚地直接快速地檢測(cè)出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬的基因。

33、,69,基因表達(dá)分析示意圖,,70,由于生物芯片技術(shù)可直接測(cè)到mRNA的種類及豐度，所以它是研究基因表達(dá)的有力工具。基因芯片種包含了幾萬種人工合成的寡核苷酸探針或cDNA，可檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從幾個(gè)數(shù)量級(jí)到每個(gè)細(xì)胞的幾個(gè)拷貝，均能被定量研究，被檢測(cè)目的基因可多達(dá)10,000個(gè)。,71,系統(tǒng)微型化，樣品需量極小 同時(shí)研究上萬個(gè)基因的表達(dá)變化，研究效率明顯提高 能更多地揭示基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系

34、檢測(cè)基因表達(dá)變化的靈敏度高，可檢測(cè)豐度相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的表達(dá)情況 節(jié)約費(fèi)用和時(shí)間,表達(dá)譜基因芯片研究基因表達(dá)與傳統(tǒng)的Northern Blot相比有許多重要的優(yōu)點(diǎn),72,3.尋找新基因,定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療等方面是很有價(jià)值的。基因芯片技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個(gè)基因在不同時(shí)空表達(dá)方面時(shí)一項(xiàng)十分有用的技術(shù)，它具有樣品用量極少，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，便于大量篩選新基因。,73,目前，

35、大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400,000個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。,74,4.突變體和多態(tài)性檢測(cè),腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。檢測(cè)基因突變對(duì)于闡明腫瘤與遺傳病的分子機(jī)制、疾病的早期診斷具有重要意義。,75,以往研究突變和多態(tài)時(shí)多采用PCR-SS-CP、手工或自動(dòng)測(cè)序、異源

36、雙鏈分析、蛋白截短檢測(cè)等方法，所有這些都需經(jīng)過電泳環(huán)節(jié)，不能滿足大規(guī)模、低消耗和自動(dòng)化的要求。應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)時(shí)可克服上述不足，且與DNA聚合酶或連接酶結(jié)合檢測(cè)時(shí)可獲得更高的分辨率,76,Hacia等用含有96,000個(gè)寡核苷酸探針的基因芯片來檢測(cè)遺傳性乳腺癌基因BRCA1第11外顯子3.45kb長度內(nèi)的所有可能的雜合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失等，并借此確定發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)?；蛐酒部捎糜诜伟⒙殉舶?、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種

37、腫瘤的研究中，為腫瘤基因組解剖計(jì)劃（CGAP）的完成提供重要的技術(shù)支持。,77,Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。這些突變能引起對(duì)抗生素，如AZT等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用HIV芯片，包括1,040個(gè)蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因，用來研究病毒抗性發(fā)展過程中的堿基突變。,78,Chee等制造了含有135,000個(gè)25-mer探針的基因芯片來探測(cè)16.6kb的人線粒體基因組。共

38、分析了10個(gè)樣本，檢出505個(gè)多態(tài)。每個(gè)樣本可在12min內(nèi)閱讀完畢，正確率達(dá)99%。據(jù)估測(cè)，每一工作日可閱讀40個(gè)線粒體基因組，大大高于現(xiàn)在凝膠測(cè)序儀可達(dá)到的每日2個(gè)基因組水平?；蛐酒捎糜谘芯縨tDNA基因突變以及民族內(nèi)和民族間mtDNA的多態(tài)性外，還可用來揭示mtDNA基因的表達(dá)與神經(jīng)性疾病和長壽等關(guān)系。,79,SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測(cè)和分析DNA的變異及多態(tài)性。,80,基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)高效、準(zhǔn)確的DNA序列分析技術(shù)，將基

39、因芯片技術(shù)用于檢測(cè)分子突變，不僅可準(zhǔn)確地確定突變位置和類型，更可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，及至整個(gè)基因組的突變，其快速高效是其它方法無法比擬的。,81,基因芯片技術(shù)用于基因組研究可創(chuàng)造第三代遺傳圖，即將遺傳病表型于DNA上特定的基因序列聯(lián)系起來。以單核苷酸多態(tài)性（SNPs) 為標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異，若能將所有SNPs全部信息裝入生物芯片則可檢測(cè)到與之相關(guān)的基因間差異。,多態(tài)性分析,82,5.后基因組研究,基因組測(cè)序完成后，未知

40、基因的功能研究是一個(gè)十分誘人的后基因組研究課題。 斯坦福大學(xué)的Davis研究小組的研究提示DNA芯片技術(shù)將來可能應(yīng)用于人類基因組測(cè)序完成后未明開放讀碼框架ORF生物學(xué)功能的研究，可能會(huì)對(duì)深刻認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象及藥物設(shè)計(jì)帶來重大影響。,83,Davis研究小組利用DNA芯片技術(shù)對(duì)酵母缺失突變株進(jìn)行定量分析以確定酵母全序列測(cè)定完成后新發(fā)現(xiàn)的ORF的生物學(xué)功能。他們應(yīng)用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生多個(gè)ORF缺失的酵母突變株，并在缺失ORF旁引入20個(gè)核苷酸的

41、標(biāo)志序列作為缺失ORF的身份標(biāo)志，謂之"分子條形碼"（molecular bar codes），分子條形碼可與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交以便于篩選。這樣，ORF的功能測(cè)試可通過一次雜交及用同一生長選擇條件完成，大大提高了效率和準(zhǔn)確性。,84,7.疾病診斷,遺傳病相關(guān)基因的定位腫瘤疾病的診斷感染性疾病的診斷,85,7.1 遺傳病相關(guān)基因的定位,隨著HGP的發(fā)展，各種方法相繼創(chuàng)立，并應(yīng)用到基因定位中?；蛐酒夹g(shù)已成

42、為一種基因定位的高效工具。配合使用多重PCR/基因芯片，可一次篩查多種遺傳病，既經(jīng)濟(jì)又敏感可靠。,86,7.2 感染性疾病的診斷,HIV-1基因組中的rt與pro在疾病過程中易發(fā)生多種變異，從而導(dǎo)致對(duì)多種藥物的抗藥性，因此，檢測(cè)和分析其變異性與多態(tài)性具有重要臨床意義?！梢灶A(yù)測(cè)，在不久的將來，人們可望在一張基因芯片上檢測(cè)幾乎所有的病原微生物基因。,87,8.基因文庫圖譜繪制,通過確定重復(fù)基因的程度，基因芯片已用來對(duì)基因組文庫進(jìn)行

43、圖譜繪制?；蚍綆熘械拿總€(gè)克隆的所有化學(xué)反應(yīng)均一個(gè)反應(yīng)管，可以快速平行地對(duì)多克隆進(jìn)行圖譜繪制。每人每天可對(duì)幾百個(gè)克隆進(jìn)行基因圖譜繪制。,88,9.其它應(yīng)用,藥物篩選藥物作用機(jī)制研究毒理學(xué)研究基因掃描,環(huán)境化學(xué)毒物的篩選耐藥菌株和藥敏檢測(cè),89,五.基因芯片相關(guān)生物信息學(xué)問題,基因芯片上核酸探針的選擇和序列設(shè)計(jì)，以及基因芯片雜交后信息的分析、處理和建庫。,兩個(gè)方面的內(nèi)容：,90,基因芯片所獲大量的基因及其基因相互作用信息，為生

44、物信息學(xué)研究和生物數(shù)據(jù)庫的挖掘提供了高效、快速和方便的實(shí)驗(yàn)工具，拓寬了生物信息學(xué)的研究內(nèi)容。,91,芯片設(shè)計(jì)的主要內(nèi)容及相關(guān)生物信息學(xué)問題,根據(jù)基因芯片的分析目標(biāo)，從相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中選取特異性基因序列，使之能夠通過與靶基因雜交而給出明確、可靠、易于分析的分子及其相互作用信息。,92,根據(jù)所選用的核酸序列進(jìn)行探針序列及其布局設(shè)計(jì)，使所設(shè)計(jì)的探針組合對(duì)靶基因的雜交特異性強(qiáng)，探針之間關(guān)聯(lián)性好。,93,探針及其空間布局的優(yōu)化：包括探針制備工藝的

45、優(yōu)化和探針雜交的優(yōu)化等諸多方面。,94,六.基因芯片的建庫與數(shù)據(jù)分析,高密度芯片獲的分子信息，已很難運(yùn)用傳統(tǒng)的論文形式來發(fā)表。目前，一些研究者通過把基因芯片的表達(dá)譜公布在自己實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站上，供其他研究者的訪問與交流。,95,由于網(wǎng)站分散以及各實(shí)驗(yàn)室所用芯片缺乏標(biāo)準(zhǔn)，使不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)交流和分析存在一定困難?；蛐酒瑪?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化問題已引起人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?，人們正考慮建立相應(yīng)的芯片數(shù)據(jù)庫。,96,一些公司與研究機(jī)構(gòu)正在發(fā)展與基因芯片的

46、相關(guān)軟件，用于構(gòu)建和管理基因表達(dá)信息的數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)比較工具。,97,五.總結(jié)摘要,基因芯片技術(shù)作為基因分析的有力武器，不僅被學(xué)術(shù)界看重，而且得到很多大公司和多國政府部門的高度重視并投以巨資進(jìn)行研究開發(fā)?；蛐酒夹g(shù)在誕生的十幾年內(nèi)就得到巨大的進(jìn)步，目前已很難從技術(shù)的角度給基因芯片下一個(gè)準(zhǔn)確的定義。,98,在芯片技術(shù)中，雖然鄰堆雜交技術(shù)彌補(bǔ)了SBH隨探針延長而特異性降低的不足，但芯片的分子生物學(xué)基礎(chǔ)已不再是雜交分析一家的天下，基于毛細(xì)管

47、電泳分析的基因芯片已經(jīng)誕生。,99,光導(dǎo)ODTA合成平板印刷術(shù)雖然第一次將基因芯片從實(shí)驗(yàn)室?guī)У搅松唐坊臅r(shí)代，但特殊的設(shè)備和昂貴的成本以及合成效率的不盡人意使它不能阻止噴印法和它競爭，而且，曾被它取代的合成點(diǎn)樣法也由于自動(dòng)化技術(shù)的進(jìn)步而獲得了新生，并在下一代芯片技術(shù)中扮演重要角色。,100,傳統(tǒng)的核酸樣品制備、DNA片段的化學(xué)反應(yīng)制備和芯片雜交分析三步曲更是顯得煩瑣，因而“縮微實(shí)驗(yàn)室”又應(yīng)運(yùn)而生?；蛐酒哂械母咝Ш怂岱治瞿芰κ顾?/p>