聯(lián)合抑制消減雜交及基因芯片技術(shù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)基因.pdf

1、論文一
　　 研究背景和目的：腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素，多步驟的生物化學(xué)過(guò)程，轉(zhuǎn)移表型的獲得與多種轉(zhuǎn)移效應(yīng)基因的表達(dá)改變密切相關(guān)，因此，尋找新的轉(zhuǎn)移效應(yīng)基因?qū)τ谏钊胙芯磕[瘤轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，及尋找新的治療靶點(diǎn)都意義重大。目前，各種差異基因篩選技術(shù)在尋找轉(zhuǎn)移效應(yīng)基因中運(yùn)用廣泛，其中，抑制性消減雜交是Diatchenko 等1996年提出的一種較成熟的篩選差異表達(dá)基因技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、假陽(yáng)性率低、可有效分離低豐度差異表達(dá)

2、基因等優(yōu)點(diǎn)。但是，在通過(guò)SSH 獲得較為全面的差異產(chǎn)物的同時(shí),仍然有少數(shù)表達(dá)相似的基因未被消減而保留下來(lái)，且SSH 只能篩選出表達(dá)差異基因，卻不能量化其表達(dá)差異，這些都給后期的分析工作造成一定困難?；蛐酒軌蛲瑫r(shí)檢測(cè)大量基因的表達(dá)，將其用于消減文庫(kù)的分析能夠簡(jiǎn)化文庫(kù)的后期分析工作。本實(shí)驗(yàn)中，我們將前期建立的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3M-1E8和PC3M-2B4的消減雜交文庫(kù)序列制作成基因芯片，與PC3M-1E8和PC3M-2B4的cDNA

3、進(jìn)行雜交，從中進(jìn)一步篩選出表達(dá)差異較大的基因，測(cè)序及功能驗(yàn)證。從中選出annexinII 初步研究了其與前列腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。還對(duì)前期在卵巢癌基因芯片中發(fā)現(xiàn)的CXCL14的功能及機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 方法：
　　 1．將前期建立的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3M-1E8和PC3M-2B4 消減雜交文庫(kù)制備成基因芯片，與PC3M-1E8和PC3M-2B4的cDNA 進(jìn)行雜交，并對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析。
　　 2．選取基因芯片中發(fā)

4、現(xiàn)的表達(dá)差異顯著的序列進(jìn)行測(cè)序，并在GeneBank 中進(jìn)行同源性分析。
　　 3．利用RT-PCR 驗(yàn)證annexinII在不同轉(zhuǎn)移潛能的配對(duì)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)annexinII在臨床前列腺癌標(biāo)本中的表達(dá)水平，及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 4．基因工程技術(shù)構(gòu)建CXCL14 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)CXCL14的克隆SKOV3/CXCL14。應(yīng)用單層傷口愈合實(shí)驗(yàn)，CFSE，軟

5、瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)等方法研究外源性過(guò)表達(dá)CXCL14 對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖，遷移能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1．基因芯片驗(yàn)證共有56個(gè)序列在PC3M-1E8和PC3M-2B4 中的表達(dá)差異大于兩倍，測(cè)序及同源性分析其中包括17個(gè)已知基因及2 條未知EST。
　　 2．a(chǎn)nnexinII在低轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞株高表達(dá)，在高轉(zhuǎn)移株中低表達(dá),在前列腺癌中表達(dá)下調(diào),且與Gleason 評(píng)分具有相關(guān)性。
　　 4．

6、成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1/CXCL14,篩選出穩(wěn)定表達(dá)的克隆。單層傷口愈合實(shí)驗(yàn)，CFSE，軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性表達(dá)CXCL14的SKOV3 細(xì)胞遷移及增殖能力均減弱。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了PC3M-1E8和PC3M-2B4的雙向消減雜交文庫(kù)，通過(guò)DNA 芯片技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證文庫(kù)中序列，選取部分表達(dá)差異較大的序列測(cè)序，在Genebank 中同源性分析，發(fā)現(xiàn)17 條已知基因及2

7、 條未知EST。從中選取了進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　 驗(yàn)證annexinII在不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞株及臨床前列腺不同標(biāo)本中表達(dá)，結(jié)果顯示，annexinII的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān).
　　 探討CXCL14的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在SKOV3 中過(guò)表達(dá)CXCL14 可以抑制其增殖及遷移能力。
　　 論文二
　　 目的：驗(yàn)證Annexin Ⅱ基因在不同腫瘤細(xì)胞系及腫瘤轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶中的表達(dá)，探討其與腫瘤轉(zhuǎn)移的相

8、關(guān)性。
　　 方法：通過(guò)RT-PCR 驗(yàn)證Annexin Ⅱ在不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平；利用實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證其在35例不同前列腺癌中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：Annexin Ⅱ在高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞PG-BE1,MDA-MB-231 中表達(dá)較低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株P(guān)G-LH7，MCF-7 明顯上調(diào)，但在前列腺癌中明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：Annexin Ⅱ的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 論文三
　　 目

9、的：研究CXCL14 外源性表達(dá)對(duì)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞株體外增殖和運(yùn)動(dòng)能力影響.
　　 方法：構(gòu)建CXCL14 真核表達(dá)載體pcDNA3.1/CXCL14,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/CXCL14的SKOV3 細(xì)胞系,應(yīng)用RT-PCR、cfse-流式細(xì)胞測(cè)定和體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等方法觀(guān)察轉(zhuǎn)染前后SKOV-3 細(xì)胞細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的變化。
　　 結(jié)果：與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV-3 細(xì)胞相比，SKOV-3/CXCL14

10、 細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力都明顯降低。
　　 結(jié)論:CXCL14 顯著抑制了人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞的體外增殖和運(yùn)動(dòng)能力。CXCL14的過(guò)表達(dá)能夠抑制卵巢癌的惡性表型，有望成為卵巢癌免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　 論文四
　　 目的：篩選高低轉(zhuǎn)移能力人肺癌細(xì)胞株P(guān)G-BE1和PG-LH7 間差異表達(dá)基因.
　　 方法：進(jìn)行兩次抑制性消減雜交(SSH)，第一次以PG-BE1 細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)方，PG-LH7 株為驅(qū)動(dòng)