利用基因芯片技術(shù)篩選奶牛外周血熱應(yīng)激相關(guān)基因.pdf

1、熱應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的分析與闡釋,對(duì)于控制熱應(yīng)激反應(yīng),使動(dòng)物表現(xiàn)出最佳的生理性能,在高溫環(huán)境下保持正常的生理狀態(tài)和健康體能,都具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此,對(duì)于熱應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的分析,尤其是其分子遺傳機(jī)制的研究,一直都是生命科學(xué)研究的一個(gè)重要方向。本試驗(yàn)以金華伊康乳業(yè)奶牛場(chǎng)30頭中國(guó)荷斯坦牛和25頭含25％以色列荷斯坦牛血統(tǒng)的雜交中國(guó)荷斯坦牛作為研究對(duì)象,分別從尾靜脈采8mL血液作為試驗(yàn)材料。動(dòng)物間耐熱能力不同,是由其耐熱性狀相關(guān)的基

2、因表達(dá)差異所決定的。將新鮮的血液分別在42℃熱暴露不同時(shí)間,也會(huì)引起熱應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異。因此采用Affymetix公司的基因表達(dá)譜芯片篩選并研究了各組間相同處理及各組內(nèi)不同處理之間的差異表達(dá)基因,即熱應(yīng)激相關(guān)基因。芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶牛的CCL3基因在中國(guó)荷斯坦牛熱激1小時(shí)和4小時(shí)后表達(dá)上調(diào),且Genbank上沒(méi)有其全序列。因此克隆了奶牛CC13的全長(zhǎng)片段,并進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果如下:
　　 ①將芯片數(shù)

3、據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析,得到差異表達(dá)基因257個(gè),其中基因表達(dá)上調(diào)139個(gè),基因表達(dá)下調(diào)118個(gè)。這些差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞凋亡(22/4,即上調(diào)基因22個(gè),下調(diào)基因4個(gè),下同)、免疫應(yīng)答(37/14)、氧化還原(3/8)、細(xì)胞增殖與分裂(5/7)、代謝相關(guān)(14/19)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(14/8)及調(diào)控轉(zhuǎn)錄(16/5)、其它(26/62)等生物功能和過(guò)程。這些過(guò)程都與奶牛的熱應(yīng)激反應(yīng)息息相關(guān),反映了熱應(yīng)激過(guò)程的分子變化基礎(chǔ)。其中熱休克蛋白家族和趨

4、化因子家族與奶牛的熱應(yīng)激關(guān)聯(lián)尤為緊密。
　　 ②成功克隆了奶牛CCL3的全長(zhǎng)cDNA序列,共829bp,其5'UTR較之NM174511延伸了15bp,3'UTR延伸了453bp。其中5'UTR長(zhǎng)度為83bp(1～83bp)；開(kāi)放閱讀框282bp(84～365bp),編碼93個(gè)氨基酸:3'UTR464bp(366～829bp)。其中終止密碼子后的407bp處出現(xiàn)動(dòng)物mRNA中常見(jiàn)的加尾信號(hào)AAUAA,其后延伸22bp即出現(xiàn)pol

5、yA尾。發(fā)現(xiàn)在開(kāi)放閱讀框的+8位T→C,+9位C→G,+10位G→C,+195位T→C突變。且使蛋白的第3位纈氨酸→丙氨酸,第4位丙氨酸→脯氨酸。
　　 ③分析結(jié)果顯示奶牛CCL3蛋白是分子量為10117.7D,pI為6.11,親水性評(píng)估為0.246,脂溶指數(shù)為83.98的疏水性蛋白。哺乳動(dòng)物順CCL3蛋白的同源比對(duì)結(jié)果顯示奶牛CCL3蛋白與亞洲水牛同源性最高為95％,與其他哺乳動(dòng)物依次為豬88％；貓81％；馬79％:兔和大鼠7

6、5％；犬74％；倉(cāng)鼠73％；小鼠72％；棉鼠、人和黑猩猩70％,獼猴則僅有66％。
　　 ④在蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)、糖基化、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)奶牛CCL3蛋白存在信號(hào)肽序列,且最可能的切割位點(diǎn)在23S和24A氨基酸殘基間。3A(Ala)丙氨酸和47I(Ile)異亮氨酸殘基可能存在糖基化位點(diǎn)。44S的絲氨酸(Ser)、30T和67T的蘇氨酸(Thr)和38Y的酪氨酸(Tyr)存在磷酸化位點(diǎn)。功能域分析中發(fā)現(xiàn)奶牛CCL3蛋白存在che