應(yīng)用基因芯片篩選胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及生物信息學(xué)研究.pdf

1、研究背景:胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在各類惡性腫瘤中居第二位,死亡率居各類惡性腫瘤之首.早期胃癌預(yù)后較好,而進(jìn)展期胃癌預(yù)后很差,5年生存率僅為10﹪～30﹪.胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差的根本原因,腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑,約占術(shù)后胃癌復(fù)發(fā)的50﹪左右,是胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)并導(dǎo)致死亡的最常見原因.因此研究胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于腫瘤患者的診斷和治療具有十分重要的意義.腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)控,是多種生物分子和信號(hào)通路相互作用的

2、復(fù)雜的生物學(xué)過程.傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)基因,很難詮釋腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的全過程.基因芯片是檢測(cè)腫瘤基因差異表達(dá)譜最有效的技術(shù)之一,它對(duì)于探討胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找胃癌早期診斷、預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物和基因治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義. 目的：本研究采用基因表達(dá)譜芯片比較癌旁非腫瘤胃粘膜、胃癌原發(fā)灶和胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)譜,旨在篩選與胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,為進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移

3、的分子機(jī)制,尋找胃癌早期診斷、預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物和基因治療靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用TRIzol分別提取非腫瘤胃粘膜(A組)、胃癌原發(fā)灶(B組)和胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(D組)組織的總RNA,用HPLC純化T7-(d7)24 primer反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,經(jīng)Phase Lock Gel(PLG)-酚氯仿純化后,以三種組織的cDNA為模板,應(yīng)用Affymetrix公司的BioArray High Yield RNA Tran

4、script Labeling kit進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄,同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記,合成生物素化的cRNA探針.合成好的cRNA探針質(zhì)控合格后經(jīng)片段化處理(大小約50-200bp之間),分別在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix RHybridization Oven 640中與AffymetrixGenechipRHG-U133A2.0(包括22,277個(gè)轉(zhuǎn)錄本,對(duì)應(yīng)于約20,247個(gè)人己知基因和1475個(gè)EST)雜交16小時(shí)

5、,雜交后的芯片經(jīng)過洗脫、染色處理,使用AffymetrixRScarmer3000 7G對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行掃描,芯片掃描后獲得的數(shù)據(jù)利用AffymetrixRGCOS software進(jìn)行計(jì)算處理.在比較兩組芯片的結(jié)果之前,先對(duì)每張芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理.以Signal Log Ratio≥1.0或≤-1.0(表明轉(zhuǎn)錄本的水平至少提高或降低2倍)和Change p-value(代表了兩張不同芯片之間一個(gè)探針對(duì)表達(dá)水平相同或不同的可能性)≤

6、0.05(表明比較的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn),并用生物信息學(xué)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析.為確保芯片檢測(cè)質(zhì)量,Affymetrix基因芯片內(nèi)還設(shè)有GAPDH等看家基因作為對(duì)照,以及BIOB、BlOC、BIOD和CRE等外加的陽(yáng)性對(duì)照以檢測(cè)基因芯片的質(zhì)量.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time-PCR)定量檢測(cè)4個(gè)基因(COL1A2、SPPl、MUCl和TFF3)在三種組織的表達(dá)情況,以驗(yàn)證基因芯片的檢測(cè)結(jié)果. 結(jié)果

7、：基因芯片檢測(cè)報(bào)告表明,這三張芯片的背景值和噪音值都很均勻,其中管家基因GAPDH的5'端和3'端的信號(hào)比值分別是1.26、1.05和1.17,均顯著低于標(biāo)準(zhǔn)值3.0;外加的陽(yáng)性對(duì)照BIOB、BIOC、BIOD和CRE也被檢測(cè)到,并且信號(hào)強(qiáng)度隨著濃度由低到高呈現(xiàn)由弱到強(qiáng)的趨勢(shì),表明芯片質(zhì)量良好,雜交及檢測(cè)體系正常,芯片檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信.利用Affymetrix公司的GCOS分析軟件對(duì)三組樣品的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,并根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異

8、表達(dá)基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中胃癌原發(fā)灶組(與癌旁非腫瘤胃粘膜相比)表達(dá)上調(diào)≥2倍的有434個(gè)基因和169個(gè)EST,表達(dá)上調(diào)≥4倍的有54個(gè)基因和18個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)≥2倍的有589個(gè)基因和369個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)≥4倍的有90個(gè)基因和43個(gè)EST;胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與癌旁非腫瘤胃粘膜相比)表達(dá)上調(diào)≥2倍的有432個(gè)基因和196個(gè)EST,表達(dá)上調(diào)94倍的有65個(gè)基因和34個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)≥2倍的有505個(gè)基因和324個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)>t

9、4倍的有95個(gè)基因和56個(gè)EST.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達(dá)上調(diào)≥2倍的有802個(gè)基因和454個(gè)EST,表達(dá)上調(diào)≥4倍的有93個(gè)基因和39個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)≥2倍的有個(gè)896基因和398個(gè)EST,表達(dá)下調(diào)≥4倍的有73個(gè)基因和28個(gè)EST.本文只列出了各組差異表達(dá)基因最顯著的前40個(gè)基因.根據(jù)GO(Gene Ontology)分類和聚類分析,按照其參與的生物學(xué)過程(Biological:Process)和分子功能(Molecular F

10、unction),進(jìn)行了初步的功能分類.在這些差異基因中,胃癌原發(fā)灶組織高表達(dá)基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)活性和結(jié)構(gòu)分子活性等方面,胃癌原發(fā)灶組織低表達(dá)基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)分子活性等方面.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達(dá)上調(diào)的基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

11、和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等方面,胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達(dá)下調(diào)的基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、結(jié)合、代謝、細(xì)胞周期、酶調(diào)節(jié)活性、信號(hào)傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等方面.同時(shí)我們通過生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件(隊(duì)列試驗(yàn)的基因表達(dá)譜分析、基于Gene Ontology分類的集群分析和Pathway分析)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,結(jié)果顯示A、B、D組連續(xù)下調(diào)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)具有顯著性(P<0.05),A、B、D組連續(xù)上調(diào)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)具有顯著性(P<0.05

12、).在Apoptosis pathway中IRF3在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織高表達(dá),IRF2在胃癌原發(fā)灶低表達(dá),PRFl和BIRC3在胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均低表達(dá),TRAF2在胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均高表達(dá).在Integrin-mediated_cell_adhesion pathway中HRAS和ITGA3在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織高表達(dá),CAPN1在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織低表達(dá),VASP在胃癌原發(fā)灶低表達(dá),SORBS1、RAC2和ITGA4在胃癌

13、原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均低表達(dá).這些基因的異常表達(dá)提示這些基因可能在胃癌形成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用. 結(jié)論： 1.基因芯片是一個(gè)高效、快速的篩選胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的方法. 2.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與胃癌原發(fā)灶比)表達(dá)上調(diào)的基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等方面,胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與胃癌原發(fā)灶比)表達(dá)下調(diào)的基因功能主要集中在細(xì)胞凋亡、結(jié)合、代謝、細(xì)胞周期