利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)篩選及乙烯利誘導(dǎo)黃瓜莖尖雌性表達(dá)相關(guān)基因.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)屬葫蘆科(Cucurbitaceae)中幼果帶刺的栽培品種,以幼嫩的果實(shí)供食用,結(jié)果能力強(qiáng),產(chǎn)量高。應(yīng)振士等(1990)認(rèn)為黃瓜是研究植物性別決定和性別分化的好材料。黃瓜為雌雄同株植物,性器官的敗育發(fā)生在形態(tài)發(fā)生晚期,單性花的性別決定取決于植物個(gè)體的基因型與環(huán)境條件的相互作用。
　　 影響黃瓜性別的基因中起主要作用的是m、F和A基因。但不論作用多強(qiáng),其表達(dá)也要受到其他基因和環(huán)境的影響。

2、黃瓜的性別決定對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑處理非常敏感,適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑處理可使黃瓜的性別向不同的方向轉(zhuǎn)化。乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化,乙烯的作用看來是明確而且關(guān)鍵性的,其作用位點(diǎn)是莖尖。并且許多因素可以影響植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)性別的作用,如處理時(shí)的發(fā)育時(shí)期,植物生長調(diào)節(jié)劑處理的濃度和處理次數(shù),環(huán)境因素(特別是溫度和光周期)等。
　　 雖然利用遺傳分析已對(duì)黃瓜的性別決定遺傳有一些了解,但有關(guān)性別基因作用的機(jī)理、細(xì)胞遺傳以及植物激素(尤其

3、是乙烯)是怎樣參與調(diào)控性別決定過程等方面的研究尚少報(bào)道。因此,要用分子生物學(xué)的方法分離出有關(guān)的基因,仍需大量的工作。
　　 本研究以黃瓜雄性系品種D06103為試材,利用150mg/L的乙烯利處理黃瓜兩葉一心時(shí)期的莖尖,以處理組莖尖為Tester,對(duì)照組莖尖為Driver,利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建性別決定時(shí)期乙烯利處理的黃瓜莖尖cDNA文庫,篩選乙烯利誘導(dǎo)黃瓜雌性表達(dá)相關(guān)基因,并對(duì)文庫篩選出的11個(gè)基因進(jìn)行了表達(dá)分析。

4、在此基礎(chǔ)上利用電子克隆技術(shù)克隆出3個(gè)黃瓜雌性表達(dá)相關(guān)基因的cDNA全長,并分別對(duì)其組織特異性表達(dá)進(jìn)行了研究。
　　 試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.確立了外源激素乙烯利對(duì)黃瓜兩葉一心時(shí)期的誘雌效果最佳的濃度為150mg/L,并且不同濃度的乙烯利對(duì)黃瓜第一雌花節(jié)位影響不顯著,但是對(duì)植株上雌花占總花數(shù)的百分比影響差異顯著。乙烯利誘導(dǎo)后黃瓜雌、雄花芽掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),雌花中的雄蕊發(fā)育后期受到抑制,而雄花發(fā)育正常。
　　 2.

5、構(gòu)建乙烯利誘導(dǎo)后黃瓜莖尖的SSH文庫,經(jīng)過反向Northern雜交后得到120個(gè)陽性克隆,利用CAP3軟件進(jìn)行聚類和拼接,獲得乙烯利誘導(dǎo)后特異增強(qiáng)表達(dá)的UniESTs103個(gè),其中包括14個(gè)Contigs和89個(gè)Singlets。在GenBank上進(jìn)行同源比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)其中有99條可以找到已知的同源序列,占全部EST的96.1％;4條沒有顯著匹配結(jié)果,占全部EST的3.9％。有73條ESTs功能已知,占全部ESTs的73.7％;26條功能

6、未知,占全部EST的26.3％。利用GeneOntology進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)除未知功能外,很多基因涉及新陳代謝(尤其是光合作用)還有蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞間通訊和能量代謝等過程。
　　 3.對(duì)文庫篩選得到的部分基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,根據(jù)分析結(jié)果推測乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因CS-EBF1、胞內(nèi)甲基化作用相關(guān)基因CS-SAHH、參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因CS-PPR以及光合作用相關(guān)基因CS-RBCL和CS-CAB8與黃瓜乙烯利誘導(dǎo)后的雌性表達(dá)密

7、切相關(guān)。
　　 4.克隆了黃瓜CS-EBF1基因,并對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測?；蚓幋a區(qū)全長為1964bp,編碼640個(gè)氨基酸。該基因與擬南芥中的EBF1基因有67％的核苷酸序列相似性。蛋白含有部分F-box保守區(qū)域和LRRs區(qū)。CS-EBF1基因的表達(dá)分析表明在根、莖、葉、莖尖都受到乙烯利的誘導(dǎo)表達(dá),并且在雌花芽中表達(dá)強(qiáng)于雄花芽,推測其與黃瓜雌花發(fā)育密切相關(guān)。
　　 5.克隆了瓜CS-SAHH基因,并對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行

8、了預(yù)測?；蚓幋a區(qū)全長1545bp,編碼485個(gè)氨基酸。黃瓜CS-SAHH氨基酸序列與苜蓿的同源性為63％。該基因編碼的蛋白有兩個(gè)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能區(qū)?；虮磉_(dá)分析表明,其在乙烯利誘導(dǎo)的黃瓜莖尖中表達(dá)增強(qiáng),而在雄花的雄蕊中表達(dá)弱于雌花的各個(gè)部位。推測甲基化修飾作用參與黃瓜雄蕊的發(fā)育。
　　 6.利用生物信息學(xué)手段克隆了黃瓜CS-PO基因,該基因開放讀碼區(qū)為791bp,編碼237個(gè)氨基酸。該蛋白可能存在2個(gè)凝血