應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)研究外周血嗜酸細(xì)胞支氣管哮喘相關(guān)基因的差異表達(dá).pdf

1、目的:應(yīng)用抑制消減雜交(Supression Subtractire HybridizationSSH)技術(shù)探討支氣管哮喘病人嗜酸細(xì)胞基因的差異表達(dá),力求在基因水平闡明支氣管哮喘的發(fā)病的本質(zhì).方法:選擇典型的支氣管哮喘病人,在治療前后取外周血并用不連續(xù)密度梯度法分離其嗜酸細(xì)胞.分別提取嗜酸細(xì)胞的總RNA,利用以RT-PCR為基礎(chǔ)的SMARTTM技術(shù)合成cDNA,酶切后分別連接不同的接頭,進(jìn)行兩步消減雜交、兩輪PCR來擴(kuò)增差異表達(dá)的基因片

2、斷,構(gòu)建消減cDNA文庫,使用differential screening技術(shù)對所構(gòu)建的文庫進(jìn)行篩選,鑒定陽性克隆并測序,登陸GeneBank進(jìn)行同源性比對.對部分有意義差異表達(dá)的基因進(jìn)行Virtual Northern Blot分析.結(jié)論:以微量總RNA為模板利用SMARTTM技術(shù)合成cDNA,解決在有限起始物的情況下需要合成足夠量cDNA進(jìn)行SSH的矛盾.成功應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)研究支氣管哮喘患者外周血嗜酸粒細(xì)胞哮喘相關(guān)基因的差異

3、表達(dá),構(gòu)建了外周血嗜酸粒細(xì)胞支氣管哮喘相關(guān)基因的cDNA消減文庫.發(fā)現(xiàn)了TAK1編碼基因、環(huán)磷酸核苷酸門控通道編碼基因、ATP合成酶F6亞單位編碼基因、細(xì)胞色素C亞單位Ⅰ和Ⅱ編碼基因、輔酶ⅡD環(huán)DAN融合蛋白編碼基因、ATP合成酶F0亞單位6、富組胺肌漿網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白編碼基因、DAZ關(guān)聯(lián)蛋白2編碼基因、骨肉瘤甲狀旁腺反應(yīng)D1蛋白編碼基因、在惡性黑色素瘤中差異表達(dá)的mRNA、和線粒體As9Y基因組基因等12個(gè)差異表達(dá)的基因.間接證實(shí)了在支氣