應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)研究胃癌差異表達基因.pdf

1、【目的】胃癌是一種常見的惡性腫瘤.在惡性腫瘤死亡率中占第二位.人體中每個細胞均具有相同的一套基因組.但何種基因表達及其表達量決定了細胞的命運.正常細胞惡性轉(zhuǎn)化后基因表達也隨之改變.因此分離和鑒別胃癌的差異表達基因是非常必要的.研究基因表達差異的方法很多,該研究的目的是應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)鑒定胃癌與正常胃組織之間的差異表達基因.【方法】標本來自胃竇部低分化腺癌的病人,術(shù)中分別取腫瘤組織和遠切端正常組織,立即投放入液氮中備用.兩標本都經(jīng)過

2、病理證實.采用TRIZOL試劑提取腫瘤和正常組織的RNA,然后用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Purification Kit抽提mRNA.采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kits進行抑制性消減雜交.在正向消減中,正常胃組織作為tester胃癌組織作為driver,而在反向消減中,正常胃組織作為driver而胃癌組織作為tester.二級PCR產(chǎn)物連接入QIAGEN公司P

3、CR Cloning plus Kit的pDrive Cloning Vector然后轉(zhuǎn)化EZ Competent Cells.菌液在表面覆蓋X-Gal/IPTG的氨芐青LB平板上鋪板.培養(yǎng)過夜后在正常胃組織的消減文庫中獲得105個克隆,在胃癌組織的消減文庫中獲得53個克隆.挑出所有克隆在3-5ml含100μg/ml的氨芐青的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜.抽提純化所有消減克隆的質(zhì)粒DNA,然后用BamH1和Xbal酶切.通過電泳,在2％的瓊脂糖

4、EB膠中區(qū)分不同大小的消減cDNA片段.用含不同cDNA片段的消減克隆進行測序.用BLAST程序進行核酸同源性分析.RT-PCR驗證SSH結(jié)果.從腫瘤組織的SSH文庫中挑選TGFBI和FSTL1,應(yīng)用半定量RT-PCR的方法研究它們在22例胃癌病人的腫瘤組織和正常組織中的表達情況.【結(jié)論】綜上所述,我們認為SSH是一種能夠快速的從基因表達譜中鑒別差異表達基因的方法.通過這種方法,我們在正常胃組織的消減文庫中獲得7個差異表達基因,在胃癌組