結(jié)直腸腺瘤-正常黏膜抑制性差減雜交文庫的系統(tǒng)性分析及差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、為了驗(yàn)證A-N文庫篩選的結(jié)果，我們對文庫中代表性基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。我們選擇了文庫中出現(xiàn)次數(shù)相對較多的REG4、PERP、YWHAZ及KLF4基因，采用SYBR Green熒光定量PCR方法在8例結(jié)直腸正常黏膜-腺瘤-腺癌(N-A-T)配對組織，49例結(jié)直腸正常黏膜-腺癌(N-T)配對組織中檢測其mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示在受檢的8例N-A-T配對、49例N-T配對樣本中，REG4在7例腺瘤，23例腺癌中的表達(dá)

2、高于配對正常黏膜(中位表達(dá)倍數(shù)分別為2.263、0.982)，并在6例N-A-T配對組織腺瘤中的表達(dá)高于正常黏膜及腺癌。其在腺瘤中的表達(dá)顯著高于配對正常黏膜(p=0.036)。PERP在6例腺瘤，39例腺癌中的表達(dá)高于正常黏膜(中位表達(dá)倍數(shù)分別為2.146、1.941)，并在5例N-A-T配對組織的腺瘤中的表達(dá)高于正常黏膜及腺癌。PERP在腺瘤及腺癌中的表達(dá)均顯著高于配對正常黏膜(p=0.036，p=0.000)。YWHAZ在5例腺瘤，

3、31例腺癌中的表達(dá)高于正常黏膜(中位表達(dá)倍數(shù)分別為1.339、1.200)，其在4例N-A-T配對組織的腺瘤中的表達(dá)高于正常黏膜及腺癌，其在腺癌中的表達(dá)顯著高于配對正常黏膜(p=0.03)。KLF4僅在2例腺瘤，4例腺癌中高表達(dá)(中位表達(dá)倍數(shù)分別為0.521、0.230)，而其在腺癌中表達(dá)顯著低于配對正常黏膜(p=0.000)。至此，A-N文庫篩選出的在結(jié)直腸腺瘤中高表達(dá)的基因得到了較好的驗(yàn)證。加上前期已驗(yàn)證的6個(gè)核糖體蛋白基因及C6o

4、rf37基因，體現(xiàn)了SSH方法的可靠性。 鑒于PERP是新近發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中低表達(dá)的新基因，可能是p53下游的效應(yīng)分子。因此，我們對在結(jié)直腸腺瘤及腺癌中均顯著高表達(dá)的PERP基因進(jìn)行了表達(dá)及功能的深入研究。首先，利用組織芯片(TMA)結(jié)合RNA原位雜交(ISH)和免疫組化(IHC)技術(shù)，分別從mRNA及蛋白水平檢測了PERP在結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PERP mRNA在結(jié)直腸正常黏膜的隱窩下部表達(dá)較上部高，其在結(jié)

5、直腸正常粘膜、腺瘤及腺癌組織中表達(dá)率分別為62.5％，97.6％，88.9％。PERP在結(jié)直腸腺瘤、腺癌組的表達(dá)顯著高于正常粘膜組(p=0.000，p=0.000)，腺瘤與腺癌組無顯著差異(p=0.249)，其在腺瘤及腺癌中的表達(dá)顯著高于配對正常黏膜(p=0.046，p=0.000)。PERP蛋白在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤及腺癌組織中表達(dá)率分別為67.7％，84.2％，81.5％。腺瘤與腺癌組的表達(dá)顯著高于正常黏膜組(p=0.001，p=0

6、.001)，腺瘤組與腺癌組間無顯著差異(p=0.564)。PERP蛋白在腺癌中的表達(dá)顯著高于其配對正常黏膜(p=0.000)。為了探究PERP表達(dá)與p53蛋白表達(dá)的關(guān)系，我們對同批組織芯片進(jìn)行了p53蛋白的檢測。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，p53蛋白在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤及腺癌組織中表達(dá)率分別為3.17％，78.10％，71.90％。腺瘤組及腺癌組中的表達(dá)顯著高于正常黏膜組(p=0.000，p=0.000)，腺瘤與腺癌組間差異不顯著(p=0.170)

7、。其在腺癌中的表達(dá)顯著高于配對正常黏膜(p=0.000)。隨后，我們進(jìn)行的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PERP mRNA及蛋白水平與p53蛋白水平均成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.452(p=0.000)；r=0.341(p=0.000)。 為探討PERP在結(jié)直腸腫瘤中的可能作用，我們構(gòu)建含有PERP全長編碼區(qū)的真核表達(dá)型質(zhì)粒PcDNA3.1-PERP CDs，對不表達(dá)或低表達(dá)內(nèi)源性PERP基因的結(jié)直腸癌LoVo和RKO細(xì)胞株進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)染

8、，并檢測了轉(zhuǎn)染PERP后的生物學(xué)效應(yīng)。通過G418藥物篩選，我們得到穩(wěn)定表達(dá)外源性PERP的LoVo-CDs和RKO-CDs細(xì)胞株。MTT細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染PERP能促進(jìn)LoVo和RKO細(xì)胞株的生長(p=0.000,p=0.058)。PI單染，PI/Annexin V雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染PERP對LoVo和RKO細(xì)胞株的凋亡和周期無明顯影響。檢測細(xì)胞遷移能力的劃痕實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染PERP基因，增強(qiáng)了LoVo細(xì)胞株的遷移

9、能力。 但是，由于構(gòu)建A-N文庫時(shí)使用的是來源于一個(gè)病例的樣本，造成了篩選結(jié)果的偏倚。如我們發(fā)現(xiàn)KLF4基因Q-PCR的驗(yàn)證結(jié)果與文庫篩選結(jié)果相反。但是，新近不少研究發(fā)現(xiàn)KLF基因家族與細(xì)胞的分化成熟有關(guān)，已成為癌癥研究中的熱點(diǎn)。腸道由于其黏膜隱窩的增殖-分化動(dòng)力學(xué)，成為研究細(xì)胞分化成熟的良好模型。我們Q-PCR的結(jié)果顯示KLF4在正常黏膜-腺瘤-腺癌中的表達(dá)依次降低，該現(xiàn)象不僅提示了KLF4基因的表達(dá)與細(xì)胞分化成熟相關(guān)，更支持

10、了長期存在的“腫瘤是細(xì)胞分化紊亂或逆向分化”的理論，引起我們極大興趣。因此，我們對KLF4在結(jié)直腸中的表達(dá)情況進(jìn)行了比較全面的臨床病理研究。 首先，我們利用免疫組織化學(xué)方法檢測了KLF4蛋白在結(jié)直腸組織中的表達(dá)及分布情況。由于KLF4可能與細(xì)胞分化成熟相關(guān)，在分析免疫組化結(jié)果時(shí)，我們將結(jié)直腸黏膜隱窩分成上1/2和下1/2進(jìn)行精細(xì)定量分析。我們發(fā)現(xiàn)，所有的(73/73)的結(jié)直腸正常黏膜均表達(dá)KLF4，KLF4+細(xì)胞主要位于隱窩上部

11、。隱窩上1/2陽性細(xì)胞數(shù)(35.7％±19.0％)顯著高于隱窩下1/2(11.4％±9.8％)(p<0.01)。在結(jié)直腸腺瘤，雖然KLF4+細(xì)胞數(shù)顯著低于正常黏膜，但其分布模式與正常黏膜相似，異形增生的隱窩上1/2陽性細(xì)胞數(shù)(19.7％±20.5％)顯著高于下1/2(9.0％±13.4％)(p<0.01)。腺瘤KLF4+細(xì)胞(15.0％±16.3％)顯著低于瘤旁殘留黏膜(30.6％±13.5％)。而腺癌中，KLF4彌散表達(dá)，總體陽性率僅

12、3.0％±6.72％，顯著低于配對癌旁殘留黏膜(2.0％±4.6％vs23.4％±11.5％)(p<0.01)。從整體來看，KLF4蛋白在正常黏膜(23.5％±13.0％)、腺瘤(15.0％±16.3％)、腺癌(3.0％±6.72％)中的表達(dá)依次降低，且差異均顯著(p<0.01)。結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤、腺癌KLF4陽性率分別為100％(73/73)，58.3％(28/48)、38/129(29.5％)。腺瘤與腺癌的陽性率顯著低于正常黏膜

13、(p<0.001)。低級(jí)別腺瘤中KLF4陽性率(26/39)顯著高于高級(jí)別腺瘤(2/9)(p<0.01)。在大于60歲或腫瘤芽較多(≥15)的結(jié)直腸癌病例中表達(dá)顯著下降(p<0.01，p<0.01)。KLF4表達(dá)陽性病例總體生存率(76.3％，29/38)高于KLF4陰性病例(68.1％，62/91)，陽性病例5年生存率(67.9％，19/28)高于陰性病例(51.7％，30/58)(p=0.172)，陽性病例的5年累積生存率高于陰性病

14、例(74％vs 63％，p=0.379)。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，KLF4表達(dá)陽性的預(yù)后相對陰性的病例較好(p=0.252)。 為了探討KLF4在結(jié)直腸腫瘤中低表達(dá)的原因及其與細(xì)胞分化之間的關(guān)系，我們利用去甲基化藥物5-aza-dC和促分化藥物丁酸鈉處理結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、SW620和RKO。Q-PCR檢測處理前后KLF4 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：5-aza-dC處理SW480、SW620及RKO后，KLF4的表達(dá)

15、分別升高1.14、5.49及2.10倍。丁酸鈉處理后，KLF4在SW480、SW620及RKO細(xì)胞系中的表達(dá)分別升高1.39、1.57及1.47倍。其中5-aza-dC處理顯著上調(diào)了SW620細(xì)胞株KLF4基因的表達(dá)(p<0.01)。 通過上述研究，我們得出以下結(jié)論： (1)我們成功建立了從EST測序峰圖到候選基因的核酸序列自動(dòng)化分析平臺(tái)。利用該平臺(tái)結(jié)合在線WebGestalt分析，有助于從整體水平揭示結(jié)直腸腺瘤的分子特

16、征，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期分子事件，尋找用于早期診斷、治療及預(yù)后的分子標(biāo)志物。 (2)PERP基因在結(jié)直腸腫瘤中高表達(dá)，其在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)可能與p53基因的突變有關(guān)。PERP能促進(jìn)結(jié)直腸癌LoVo，RKO細(xì)胞株的增殖和遷移能力。 (3)KLF4基因與結(jié)直腸黏膜終末分化相關(guān)。其在結(jié)直腸腫瘤中的低表達(dá)可能與其基因高甲基化狀態(tài)有關(guān)。KLF4低表達(dá)是結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。 (4)抑制性差減雜