鴨卵泡發(fā)育差異表達(dá)基因抑制性消減文庫的構(gòu)建及分析.pdf

1、禽類的產(chǎn)蛋率，除了其他方面外，取決于等級前卵泡能被有效地募集進(jìn)入等級卵泡，即通過卵泡的生長和閉鎖建立卵泡等級。隨著日齡的老化產(chǎn)蛋率的下降歸因于卵泡閉鎖的增加以及可供選擇進(jìn)入最后生長階段（最大等級卵泡/排卵前卵泡）的小/生長卵泡數(shù)量減少。對人和哺乳動(dòng)物巢卵泡發(fā)育研究表明，卵泡的生長和分化是多因素調(diào)控的復(fù)雜的生理生化過程，不僅受生殖軸內(nèi)分泌激素的調(diào)控，而且卵巢中許多局部的生長、分化因子也以自分泌或旁分泌等形式發(fā)揮重要作用。目前，對于禽類卵泡

2、發(fā)育的研究，雖然已經(jīng)知道一些基因在不同發(fā)育階段的卵泡中差異表達(dá)，但是對于復(fù)雜生命體而言，僅僅是其中很小部分，仍然沒有合理假說來說明禽類卵泡等級的建立機(jī)制。通過篩選鴨卵泡差異表達(dá)的基因，比較不同發(fā)育階段卵泡的差異表達(dá)基因，可以對這些差異基因在卵泡發(fā)育和分化過程中所發(fā)揮的作用有更深入的了解。揭示卵泡在不同生理狀況下差異基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究禽類性成熟、產(chǎn)蛋的啟動(dòng)、產(chǎn)蛋的維持和高產(chǎn)性能的分子生物學(xué)機(jī)制提供重要資料，并為最終揭示禽類卵泡發(fā)

3、育和等級建立的分子機(jī)制，從而在基因水平上進(jìn)行遺傳操作，延長產(chǎn)蛋高峰期，提高鴨的產(chǎn)蛋率提供理論依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)蛋高峰期紹興鴨母鴨不同階段的卵泡為實(shí)驗(yàn)材料，采用DSN酶介導(dǎo)的均一化消減雜交方法構(gòu)建鴨卵泡差異表達(dá)基因的消減eDNA文庫，以期找到與鴨卵泡發(fā)育相關(guān)的基因，探索卵泡等級建立與分化的基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩個(gè)鴨卵泡差異表達(dá)基因的雙向消減文庫:
　　 以最大等級卵泡和等級前卵泡這兩個(gè)不同發(fā)育階段的卵

4、泡為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行消減雜交。其中，以最大等級卵泡為Tester，等級前卵泡為Driver，建立的為正向消減文庫;以等級前卵泡為Tester，最大等級卵泡為Driver，建立的為反向消減文庫。實(shí)驗(yàn)過程中，總RNA與反轉(zhuǎn)錄成的eDNA質(zhì)量較好，消減產(chǎn)物得到很好的富集。正向消減文庫中獲得了88條獨(dú)立的差異表達(dá)的基因，BLAST比對結(jié)果顯示，其中60條具有同源基因，28條相似度極低或無同源性的基因。篩選出與卵泡發(fā)育相關(guān)基因LHR和EGFR，與細(xì)胞

5、增殖和分化有關(guān)的基因SLC家族等，影響胚胎發(fā)育的NADH1α脫氫酶同源基因NADH1β，幾個(gè)編碼激酶或其同源基因如PRKG2、AKAP2、similar to protein kinase D1。此外，篩選到我們還分離了一些未知功能的基因。反向消減文庫中獲得了72條獨(dú)立的差異表達(dá)的基因，BLAST比對結(jié)果顯示，其中51條具有同源基因，21條無相似或者同源性極低的基因。篩選出的基因有RBMⅡ，拼接因子SF2亞單位p32和U2AF35 kD

6、a subunit-like，tensin基因，真核生物翻譯起始基因EIF3I，微管組分基因α-tubulin，腸平滑肌肌動(dòng)蛋白gamma2，含靶蛋白同源基因similar to palladin，免疫反應(yīng)相關(guān)基因CD58，編碼微小染色體維持蛋白的基因MCM5，RCC2，參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基因Flotillin-2，酶類（包括激酶）及其同源基因:AFG3 ATPase family gene3-like
　　 2、 AK3L2

7、、TAOK3等基因。另外，我們還分離了一些未知功能的新基因。
　　 以最大等級卵泡和最小等級卵泡這兩個(gè)不同發(fā)育階段的卵泡為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行消減雜交。其中，以最大等級卵泡為Tester，最小等級卵泡為Driver，建立的為正向消減文庫;以最小等級卵泡為Tester，最大等級卵泡為Driver建立的為反向消減文庫。實(shí)驗(yàn)過程中，總RNA與反轉(zhuǎn)錄成的cDNA質(zhì)量較好，消減產(chǎn)物得到很好的富集，正向消減文庫中獲得了79條獨(dú)立的差異表達(dá)基因，BL

8、AST比對結(jié)果顯示，其中67條具有同源基因，12條無相似基因或者同源性極低的基因;篩選出與卵泡發(fā)育相關(guān)基因EGFR，與排卵有關(guān)的基因ADAMTS-1、影響腦神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎發(fā)育的編碼鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶基因、免疫相關(guān)基因lymphocyteantigen86-like和IL17RA，參與細(xì)胞調(diào)亡的基因death domain-containingtumor necrosis factor receptor superfamil

9、y member23，骨成形蛋白2基因。分離了一些編碼通道或轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)蛋白的基因及其同源基因sodium/myo-inositolcotransporter-like、 calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase、SLC9A8、potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member2、SLC2A1、PCTP等。除上述基因

10、外，還篩選到RNF14、TTC17、PHF21A、PLEKHB2、ADD3、RGS12、SVEP1、HDAC4、STOM、SMARCE1、SETD4、CEBPG、STRADA、ZC3H14、RHOBTB1、ALDH1A2、EXOC2和GAPVD等基因。反向消減文庫中獲得了37條獨(dú)立的差異表達(dá)的基因，比對結(jié)果顯示，其中29條具有同源基因，8條無相似或相似度極低的基因。反向文庫中篩選出的基因主要包括RBMII、微管組分基因α-tubulin