白樺花期抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建及花發(fā)育相關(guān)基因的克隆.pdf

1、本文研究了白樺花期抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建及花發(fā)育相關(guān)基因的克隆，主要工作如下： 對(duì)白樺花序進(jìn)行分期取材，基于SMART(SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript)策略，利用PCR-SelectTMcDNASubtractionKit分別構(gòu)建白樺雌雄花序抑制性消減文庫(kù)。經(jīng)多重比對(duì)分析，計(jì)算文庫(kù)冗余度，雌花正向庫(kù)為12.14％，雌花反向庫(kù)為15.48％，雄花正向庫(kù)為29.30％，雄花反向庫(kù)為27

2、.85％。去除重復(fù)EST后，設(shè)定期望閾值為e-10，經(jīng)blastX分析，去除rDNA污染和鑲嵌克隆，雌花正向庫(kù)，共容納EST數(shù)為65條；雌花反向庫(kù)中為71條；雄花正向庫(kù)中為68條；雄花反向庫(kù)中為65條。進(jìn)一步合并后，雌花消減庫(kù)共獲得126條EST，雄花消減庫(kù)共獲得115條EST。文庫(kù)中存在一些同類EST，分析表明，它們對(duì)應(yīng)著同一基因的不同片段，或是代表同一基因家族的不同成員。雌、雄花消減庫(kù)比較表明，兩者少有冗余現(xiàn)象。按GO分類系統(tǒng)，消減

3、庫(kù)中EST參與新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、跨膜運(yùn)輸、信號(hào)傳遞、脅迫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯、蛋白降解等生命過(guò)程。由于文庫(kù)構(gòu)建是以總RNA為起始材料，測(cè)序結(jié)果中有一定程度的rDNA污染。Blast比對(duì)結(jié)果表明，文庫(kù)中容納了一些明顯同花發(fā)育相關(guān)的EST，它們將成為進(jìn)一步研究白樺花發(fā)育問(wèn)題的物質(zhì)基礎(chǔ)。 根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中歐洲白樺已發(fā)表序列，通過(guò)RT-PCR手段，克隆了四個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因BpMADS1、3、5及BpSPL1，序列分

4、析表明兩種白樺在核酸及蛋白序列上存在一定差異，其中三個(gè)基因的EST未出現(xiàn)在消減文庫(kù)中，對(duì)此種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因作了推測(cè)；以消減文庫(kù)中的兩條EST為材料，通過(guò)RACE手段克隆了兩個(gè)新的花發(fā)育相關(guān)基因一BPSPL2和BPAGL2，使用TreeTOP工具對(duì)其系統(tǒng)發(fā)生位置進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。 以消減文庫(kù)中的四個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因的EST為材料，建立了外標(biāo)實(shí)時(shí)定量PCR體系。研究結(jié)果表明，幾個(gè)目標(biāo)基因均呈現(xiàn)時(shí)序表達(dá)特點(diǎn)，根據(jù)目的基因的表達(dá)模式對(duì)其可能