高鹽滲濾液COD降解優(yōu)勢(shì)菌的篩選及相關(guān)基因消減文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、濱海地區(qū)垃圾填埋場(chǎng)產(chǎn)生的滲濾液,不僅具有一般滲濾液的COD濃度高且生物難降解的特性,而且還含有較高的鹽量,常常使得生物處理工藝很難穩(wěn)定運(yùn)行。本文從滲濾液中分離出多株優(yōu)勢(shì)菌,構(gòu)建優(yōu)勢(shì)菌群,通過(guò)生物強(qiáng)化技術(shù),提高滲濾液生化處理效能。利用分子生物技術(shù),鑒別優(yōu)勢(shì)菌株。利用抑制消減雜交技術(shù),構(gòu)建優(yōu)勢(shì)菌株的消減文庫(kù),為構(gòu)建垃圾滲濾液工程菌奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究根據(jù)高鹽垃圾滲濾液的組成及特點(diǎn),通過(guò)梯度增加培養(yǎng)基中垃圾滲濾液比例的方法,分離、

2、篩選出垃圾滲濾液中的10株耐鹽菌株。再經(jīng)實(shí)驗(yàn)室搖瓶降解試驗(yàn),從中篩選出6株降解COD的優(yōu)勢(shì)菌株,并研究了溫度、接種量、pH對(duì)6株優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)的影響。
　　 將不同優(yōu)勢(shì)菌株混合配比進(jìn)行COD降解試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了以TJ06和TJ09菌株為混合配比的優(yōu)勢(shì)菌群具有較高的有機(jī)物去除效率。當(dāng)COD濃度小于7375mg/L時(shí),該優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)滲濾液的COD去除效率隨著COD初始濃度的增加而增加。當(dāng)COD濃度大于7375mg/L時(shí),優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)滲濾液的CO

3、D去除效率隨著COD初始濃度的增加而減少。
　　 菌株TJ06和TJ09具有良好的耐鹽特性。當(dāng)培養(yǎng)基中Cl-濃度小于30000mg/L時(shí),菌株TJ06和TJ09的相對(duì)生長(zhǎng)率分別大于75％和60％。隨著培養(yǎng)基中Cl-濃度的增加,兩株菌的相對(duì)生長(zhǎng)率均呈下降趨勢(shì)。當(dāng)Cl-濃度為70000mg/L時(shí),菌株TJ06培養(yǎng)24h,其相對(duì)生長(zhǎng)率只有1.11％,48h時(shí)菌株TJ06和TJ09的相對(duì)生長(zhǎng)率為40％左右;當(dāng)Cl-濃度為90000mg/

4、L時(shí),兩株菌的相對(duì)生長(zhǎng)率均小于1％,幾乎不再生長(zhǎng)。
　　 重金屬離子Zn2+、Cd2+對(duì)菌株TJ06和TJ09的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,這種抑制作用大小與培養(yǎng)基中Zn2+、Cd2+濃度呈正比。當(dāng)培養(yǎng)基中Zn2+濃度為100mg/L時(shí),菌株TJ06的相對(duì)生長(zhǎng)率為40％左右;當(dāng)Zn2+濃度大于100mg/L時(shí),TJ06幾乎不再生長(zhǎng)。菌株TJ09對(duì)Zn2+更敏感,當(dāng)Zn2+濃度大于50mg/L時(shí),TJ09的相對(duì)生長(zhǎng)率低于10％。培養(yǎng)基

5、中Cd2+濃度為50mg/L時(shí),菌株TJ06和TJ09的生長(zhǎng)就明顯受到抑制,其相對(duì)生長(zhǎng)率分別為40.59％和34.89％;當(dāng)Cd2+濃度大于150mg/L時(shí),TJ06和TJ09的相對(duì)生長(zhǎng)率均小于10％。
　　 利用16S rDNA分析技術(shù),對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行序列分析。發(fā)現(xiàn)菌株TJ06與Bacillus cereus(EU931563)和Bacillus thuringiensis(AY138288)的同源性最高,達(dá)到99％。菌株TJ

6、09與Bacillus marisflavi(FJ554665)、Bacillus aquimaris(EU835730)和Bacillus baekryungensis(EU835731)的同源性達(dá)99％。并根據(jù)序列同源性分析建立相關(guān)菌種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),確認(rèn)TJ06和TJ09均屬于Bacillus屬。
　　 為篩選優(yōu)勢(shì)菌株中COD降解相關(guān)基因,利用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)對(duì)菌株TJ06和Bacillus cereus SA1.

7、196基因組進(jìn)行比較,構(gòu)建一個(gè)庫(kù)容量為230個(gè)陽(yáng)性克隆的消減雜交文庫(kù)。通過(guò)菌液PCR進(jìn)行鑒定,擴(kuò)增出差異片段205條。對(duì)12個(gè)差異片段進(jìn)行核苷酸序列相似性比對(duì)和功能分析。結(jié)果顯示其中2個(gè)差異片段未檢索到同源序列,可能為新基因片段,其功能有待進(jìn)一步研究:7個(gè)差異表達(dá)片段,雖然找到了與其相似性很高的序列,但功能未知;其他3個(gè)差異表達(dá)片段分別與肽甲硫氨酸亞砜還原酶的編碼基因同源性達(dá)90％、與編碼莽草酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因同源性達(dá)93％、與輔酶Q細(xì)胞