牛X-、Y-精子消減Cdna文庫的篩選及差異表達基因的分析.pdf

1、雄性哺乳動物可同時產生X-、Y-精子,研究兩種精子的轉錄本對于揭示精子發(fā)育過程中的基因表達具有重要理論意義,同時在家畜性別控制技術研究中也具有重要的地位。傳統(tǒng)觀點認為,相鄰精子的基因表達產物通過細胞間橋被共享,檢測兩種性別精子的表達差異已沒有意義,然而目前沒有證據(jù)表明細胞間橋使所有的表達產物共享。為研究X-、Y-精子間基因表達差異情況,本實驗室前期構建了牛X-、Y-消減cDNA文庫。本研究采用芯片技術與序列同源性分析相結合的方法對文庫中

2、的差異表達基因進行篩選和分析,并通過real-time RT-PCR方法驗證了芯片結果的準確性。
　　 1.牛X-、Y-精子消減cDNA的篩選
　　 采用cDNA芯片技術對已構建的牛X-、Y-精子消減cDNA文庫進行篩選。根據(jù)文庫的序列中信息,選取201個代表所有unigenes clones的PCR純化產物點制了cDNA芯片；分別制備X-、Y-精子總RNA,并進行兩輪mRNA線性擴增,將得到的aRNA反轉錄為cDNA,

3、再對cDNA進行熒光標記；將cDNA芯片與標記的cDNA雜交。采用SAM軟件分析3張生物學重復芯片的數(shù)據(jù),獲得31個陽性差異表達clones,即陽性差異表達unigenes,其中4個在Y-精子中上調,27個在X-精子中上調。
　　 2.差異表達基因的序列同源性分析
　　 對經(jīng)過芯片雜交驗證的陽性差異表達基因的Blastx比對結果顯示,有12.9％的unigenes(4個contigs)與SwissProt數(shù)據(jù)庫中注釋的蛋

4、白質高度同源(E-value≤1×10-10),其中1個基因在Y-精子中上調,3個基因在X-精子中上調,并且這4個基因都與精子的基礎生命活動相關。對剩余差異表達基因的Blastn比對結果顯示,32.26％的unigenes(7個contigs和3個singlets)與牛EST數(shù)據(jù)庫中的序列高度同源(E-value≤1×10-10),認為是未知功能的基因,其中1個基因在Y-精子中上調,9個基因在X-精子中上調。其余54.84％的unige

5、nes在數(shù)據(jù)庫中未找到同源序列(E-value≥1×10-10),認為可能是新基因。
　　 3.Real-time RT-PCR對兩個基因表達情況的檢測
　　 對陽性差異表達基因細胞色素b基因(Cytochrome b,CYTB)和鐵硫簇支架蛋白基因(Iron-sulfur cluster scaffold.ISCU)在X-、Y-精子中的表達情況進行檢測,結果顯示兩個基因在X-精子中的表達量分別是在Y-精子中的1.731