系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)系列分析文庫(kù)的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、第一部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)系列分析文庫(kù)的構(gòu)建 目的：構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)文庫(kù) 方法：采集3個(gè)家族性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血各5ml，混合在一起提取單個(gè)核細(xì)胞。采用三處改良的SAGE技術(shù)構(gòu)建SAGE文庫(kù)，三處改良分別為1)用交聯(lián)有oligo(dT)25的磁珠直接抽提mRNA，并在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行雙鏈c

2、DNA的合成和NlaⅢ酶切，避免了原始SAGE方法中兩次酚/氯仿抽提、乙醇沉淀造成的DNA損失。2)進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。即在第一次100bp標(biāo)簽擴(kuò)增純化后，再行一次短循環(huán)數(shù)的PCR擴(kuò)增，以獲得足量的純度相對(duì)較高的100bp標(biāo)簽。3)利用零背景的pZErO(R)-1質(zhì)粒進(jìn)行克隆，提高了效率。隨機(jī)挑選237個(gè)轉(zhuǎn)化菌克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，以了解重組體是否轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化菌及插入片段的大小。對(duì)部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證插入片段是否符合SAGE標(biāo)簽排列

3、方式。 結(jié)果：從3個(gè)家族性紅斑狼瘡患者外周血各5ml中共分離出1.6×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。初步構(gòu)建的SAGE文庫(kù)已獲得600個(gè)克隆，隨機(jī)取237個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR分析，其中216個(gè)克隆中質(zhì)粒插入片段大于250bp，占91％。每個(gè)重組體中插入標(biāo)簽為數(shù)十個(gè)不等，以10-40個(gè)標(biāo)簽為多。對(duì)部分克隆測(cè)序證實(shí)插入的串聯(lián)體序列為數(shù)百個(gè)堿基以CATG間隔，兩個(gè)CATG之間約有20個(gè)堿基，其堿基序列排列方式符合SAGE標(biāo)簽排列。 結(jié)論

4、：對(duì)SAGE技術(shù)進(jìn)行了改良，使之可應(yīng)用于含RNA量少的組織或細(xì)胞。應(yīng)用改良SAGE的技術(shù)成功構(gòu)建了系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞SAGE文庫(kù)，可了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)譜，并為篩選系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。 第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)系列分析文庫(kù)的初步分析 目的：研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)模式。 方法：構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)

5、系列分析文庫(kù)完成后，隨機(jī)選取98個(gè)克隆進(jìn)行大規(guī)模標(biāo)簽(tag)測(cè)序，得到的98個(gè)測(cè)序文件用SAGE2000V4.5軟件分析其標(biāo)簽表達(dá)的特點(diǎn)。登陸http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGEmap網(wǎng)站，下載人類SAGE標(biāo)簽參考數(shù)據(jù)庫(kù)，將初步獲得的標(biāo)簽序列與人類SAGE標(biāo)簽參考數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞的SAGE標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的基因信息。登陸http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE

6、map網(wǎng)站，將系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞SAGE文庫(kù)中表達(dá)豐度位于前30的單配對(duì)標(biāo)簽提交查詢，獲得相對(duì)應(yīng)的基因信息。 結(jié)果：對(duì)98個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得1814個(gè)SAGE標(biāo)簽，由1286個(gè)序列不同的獨(dú)立標(biāo)簽組成。這些標(biāo)簽中，單拷貝占86.6％，2-19拷貝占13％，僅0.2％的標(biāo)簽多于20拷貝。能與已知基因相配的標(biāo)簽占68.4％，其中41.1％能與多個(gè)基因匹配；31.6％的標(biāo)簽不能和已知基因配對(duì)，它們可能代表新基因。表達(dá)豐度為