利用SSH技術篩選與鑒定小鼠MOE內受AC3調控的差異表達基因.pdf

1、在哺乳動物中,嗅覺功能的行使依賴兩個主要功能器官,即主要嗅覺表皮(MOE)和犁鼻器(VNO),研究表明MOE內嗅覺信號轉導過程是由cAMP信號通路介導的。小鼠MOE內cAMP信號通路的主要成分包括嗅覺受體、Golf蛋白、腺苷酸環(huán)化酶3(AC3)和環(huán)核苷酸門控離子通道(CNG)等。AC3基因在小鼠MOE內的嗅覺信號傳導中起著重要作用,AC3基因缺失不僅能引起小鼠嗅覺功能喪失,甚至還會影響到小鼠學習與記憶能力、生殖能力、體重等方面。但是,A

2、C3基因缺失后,是否會導致MOE內與之相關的基因發(fā)生差異表達,目前還沒有任何了解。抑制性消減雜交(SSH)技術是在消減雜交和抑制性PCR擴增基礎上建立起來的篩選差異表達基因的有效方法,其操作簡捷、準確率高、假陽性低,已被廣大研究者應用于各個領域。因此,本文利用SSH技術對AC3基因敲除小鼠MOE內受其調控的差異表達基因進行篩選,以期闡釋AC3基因對小鼠嗅覺產生影響的相關機制。
　　本文以AC3基因敲除(AC3-/-)及其同窩出生的

3、野生型(AC3+/+)小鼠MOE為材料,提取其中的RNA,并反轉錄成雙鏈cDNA,經過消減雜交,構建了正向和反向兩個消減文庫。采用dot blot方法對消減文庫進行初步篩選,并對篩選出的差異表達基因進行序列測定及生物信息學分析。利用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法對所篩選的差異表達基因的相對表達量進行分析。
　　在實驗過程中,我們獲得了高質量的總 RNA,高效率的接頭連接,對比明顯的巢式第二次PCR結果,以及獲得了差異程度10

4、-15個循環(huán)的消減雜交效率驗證結果。利用M13F和M13R引物檢驗文庫中陽性克隆,結果顯示所挑選的陽性克隆均攜帶100bp以上的目的片段。Dot blot篩選得到386個差異表達克隆,隨機選取其中的80個進行DNA序列測定,經序列比對后發(fā)現有62個在GenBank上獲得與之相匹配的基因信息,其中24個上調差異表達克隆對應于kcnk3、mapk7、megf11等基因,38個下調差異表達克隆對應于tmem88b、c-mip、skp1a、ml

5、ycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法對這些差異表達基因進行蛋白功能注釋,并在WeGo網上進行統計制圖,發(fā)現它們主要集中在分子結合、細胞周期、生物和細胞過程等功能方面。選取其中上調基因kcnk3和下調基因 c-mip、mlycd、tmem88b及 trappc5進行 qRT-PCR實驗。結果表明,在 AC3-/-小鼠MOE內kcnk3的表達量顯著上調,是對照組小鼠的127％,而c-mip、mlycd、tmem88b和t

6、rappc5的表達量顯著下調,分別為對照組小鼠的20%、7%、32%和29%。
　　上述實驗結果表明,我們利用SSH技術,成功構建了AC3基因在MOE組織內的正向與反向消減雜交文庫。并對文庫進行了dot blot篩選和qRT-PCR驗證。經過DNA測序分析及蛋白質功能注釋,發(fā)現這些差異表達基因與 K+通道、細胞發(fā)育與分化、脂肪代謝和膜蛋白轉運等生物學功能密切相關。推測它們可能與 AC3基因共同作用,影響到小鼠MOE內嗅覺電位的形成