HRM技術(shù)檢測(cè)BRAF基因T1799A突變方法的建立與初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　采用HRM技術(shù)建立一種快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)BRAF基因T1799A突變的實(shí)驗(yàn)方法，并應(yīng)用于甲狀腺腫瘤的檢測(cè)，初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.根據(jù)已知的BRAF基因T1799A突變的位點(diǎn)信息，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變特異性引物，采用高保真PCR擴(kuò)增含有野生型突變基因的片段，并通過(guò)定點(diǎn)突變方法獲取突變型基因片段。同時(shí)采用TA克隆技術(shù)獲得野生型和純合突變型的質(zhì)粒載體用于HRM檢

2、測(cè)體系的模板和基因分型對(duì)照。
　　2.通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系建立HRM技術(shù)檢測(cè)BRAF基因T1799A突變的方法，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　　3.收集176例臨床甲狀腺腫瘤患者組織標(biāo)本，采用HRM技術(shù)檢測(cè)BRAF基因T1799A突變，并與雙向基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)，探討其初步的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1.以正常人基因組DNA為模板，采用定點(diǎn)突變后成功引入BRAF基因中T-1799-A的基因突變，經(jīng)測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證分析，獲得含

3、有野生型BRAF基因T1799A突變片段和純合突變型BRAF基因T1799A突變片段的質(zhì)粒。
　　2.用分別含BRAF基因T1799A突變野生型與純合突變型基因片段的質(zhì)粒DNA作為HRM檢測(cè)體系的模板與基因分型對(duì)照，通過(guò)體系優(yōu)化建立了快速、簡(jiǎn)便的BRAF基因T1799A突變的HRM檢測(cè)方法;批內(nèi)、批間的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型、雜合型、純合突變型的Tm值和Ct值的變異系數(shù)均小于5％;該檢測(cè)體系可以對(duì)濃度范圍1pg到100ng的D

4、NA模板進(jìn)行基因分型;檢測(cè)突變雜合比例能力的結(jié)果顯示可以檢測(cè)出不低于25％的突變。
　　3.176例甲狀腺腫瘤患者組織標(biāo)本進(jìn)行BRAF基因T1799A突變檢測(cè)，結(jié)果顯示甲狀腺惡性腫瘤組檢出57.3％的突變率，對(duì)照組甲狀腺良性病變中均無(wú)此突變，與測(cè)序所得基因型結(jié)果完全相符;兩組基因突變率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.采用定點(diǎn)突變的方法和TA克隆技術(shù)成功克隆了含有BRAF基因T1799A突變片

5、段的野生型與純合突變型質(zhì)粒，為后續(xù)HRM技術(shù)檢測(cè)該基因突變的方法提供了模板與基因分型對(duì)照。
　　2.利用HRM分析技術(shù)，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的適用臨床檢測(cè)BRAF基因T1799A突變的方法，為該突變相關(guān)的臨床疾病的診斷、治療等提供可選擇的實(shí)驗(yàn)室工具。
　　3.BRAF基因T1799A突變檢測(cè)結(jié)果顯示該突變與甲狀腺惡性腫瘤有相關(guān)性，可作為今后甲狀腺腫瘤的臨床診斷指標(biāo)。該HRM技術(shù)檢測(cè)BRAF基因T1799A突變的方