猴泡沫病毒(SFV)檢測方法的建立與初步應用.pdf

1、猴泡沫病毒（Simian Foamy Virus,SFV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，泡沫反轉(zhuǎn)錄病毒亞科，是一種類似于猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）的反轉(zhuǎn)錄病毒。SFV雖然不會對靈長類動物致病，但在物種間的傳播會引起致病性的改變，猴作為一種重要的模式動物，應用于多種疾病模型，也用于相關(guān)生物制品的生產(chǎn)，因此，進一步完善對實驗猴群的質(zhì)量監(jiān)控迫在眉睫。在實驗動物病毒檢測等級標準中，猴泡沫病毒是清潔級

2、實驗動物應排除的病原體。目前，多用全病毒包被ELISA法及PCR法檢測SFV感染狀況?，F(xiàn)有檢測方法的檢測范圍有限，程序較為復雜。
　　本課題嘗試從兩個方面建立 SFV的檢測方法，一是從分子生物學方面，建立SFV核酸的PCR檢測方法及熒光定量PCR方法；二是從血清學方面，合成重組蛋白代替SFV抗原來檢測血清中的SFV抗體，并建立猴泡沫病毒的間接免疫熒光檢測法。同時，將所建立的檢測方法應用于實驗用猴及相關(guān)生物制品的檢測，以驗證其開展實

3、際應用的價值。
　　根據(jù)NCBI上發(fā)表的SFV-1的基因組序列，將其與小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等反轉(zhuǎn)錄病毒科病毒的基因組進行比對，找出差異序列，設計引物。篩選到四組引物，其中PCR引物一組，RT-nestPCR引物三組。為驗證引物的特異性，設立了小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、麻疹腮腺炎病毒和正常BHK-21細胞等多個對照。只有SFV有特定大小的目的條帶出現(xiàn)，特異性較好。對四組

4、引物進行靈敏度比較，有一組RT-nestPCR引物靈敏度最高，可檢測到的最小病毒滴度為106.3TCID50，可檢測到的最小核酸濃度為0.26pg/μL。
　　以定量的10倍系列稀釋的質(zhì)粒pGEM-T Easy-SFVpol為標準品進行熒光定量PCR擴增，建立了檢測SFV的熒光定量PCR方法。用建立的檢測方法對猴外周血淋巴細胞及脊髓灰質(zhì)炎疫苗進行檢測，并與常規(guī) PCR檢測方法作比較。結(jié)果顯示，所建立的方法靈敏度可達4705拷貝/μ

5、L，比常規(guī)PCR檢測方法靈敏度高100倍，而與小鼠白血病病毒（MuLV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）沒有交叉反應，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，適合于對猴群及相關(guān)生物制品的SFV進行批量檢測。
　　用大腸桿菌BL21(DE3)表達了gag蛋白C末端的193個氨基酸，該區(qū)域為免疫優(yōu)勢表位，有較強的診斷潛能。對表達的蛋白進行純化，并用蛋白印跡法檢驗其抗原性，與SFV抗體陽性的小鼠血清及猴血清有明顯反應，與MuLV抗體陽性的小

6、鼠血清無明顯反應，說明所表達抗原特異性良好。用方陣滴定法確定抗原的最適工作條件為：包被抗原濃度5μg/ml，BHK-21細胞正抗稀釋度1：20000，血清稀釋度1：80，羊抗人二抗稀釋度1：30000。評價猴泡沫病毒重組抗原ELISA檢測方法的精密度及重復性，并應用于實驗用猴的檢測。
　　為檢測實驗用猴群中 SFV的感染情況，建立了針對猴血清的間接免疫熒光方法（IFA）。用SFV病毒BHK-21細胞培養(yǎng)的方法制備抗原，通過濃度梯度

7、滴定，分別確定了一抗猴血清的最佳工作濃度為1:10，二抗FITC標記的羊抗人IgG抗體的最佳工作濃度為1:100。根據(jù)熒光強度可以對猴血清抗體水平進行半定量分析。
　　所建立的PCR方法可以作為SFV感染的確證方法，熒光定量PCR技術(shù)檢測SFV國內(nèi)外尚未見報道，該方法準確性好，檢測效率高，可用于猴泡沫病毒的定量檢測，為評價實驗動物猴泡沫病毒的感染狀況提供了依據(jù)。在國內(nèi)首次建立了猴泡沫病毒的重組抗原ELISA檢測方法，為SFV檢測標