大鯢蛙病毒LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、大鯢(Andrias davidianus Blanchard）俗名“娃娃魚”，屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、大鯢屬，是我國現(xiàn)存最大的也是最珍稀的物種，并被列為國家Ⅱ類重點保護野生動物。我國在上個世紀70年代對大鯢進行馴養(yǎng)和繁殖試驗，隨著大鯢人工繁殖的成功，大鯢養(yǎng)殖在陜西、四川、湖南、重慶、甘肅等省市快速發(fā)展，并逐步成為優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)。大鯢蛙病毒(Chinese Giant Salamander Ranavirus,CGSRV)是近些年來

2、發(fā)現(xiàn)的一種嚴重危害大鯢養(yǎng)殖的新型病原微生物，它感染大鯢主要表現(xiàn)為體表出現(xiàn)潰瘍及大量的出血斑點，頭部與四肢出現(xiàn)腫脹，有時形成潰瘍灶，被人們稱為“潰瘍病或大腳病”，一旦發(fā)病，很難治愈，死亡率高，甚至高達100％，故被養(yǎng)殖戶們稱為“大鯢的癌癥”。本研究建立了大鯢蛙病毒的LAMP檢測方法，以期為CGSRV的早期、快速、特異性診斷及該病的預(yù)警提供技術(shù)保障。
　　根據(jù)GenBank中登錄大鯢蛙病毒MCP基因序列（登錄號:HQ684746），利

3、用LAMP引物設(shè)計網(wǎng)站(primerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計4條特異性引物:F3:5'-GAGGGCGTACTTTTGGGC-3';B3:5'-ATGCCACCTCCATCCCA-3'; FIP:5'-TAACGTCACCCTGTCCGCTGA-CAGAGTTGTCACCTCCGC-3'; BIP5'-TCTGCCGTAATTGGTGGATCCG-GGCACCACCTCTACTC

4、CTA-3，。經(jīng)過對Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度和Bst DNA聚合酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進行優(yōu)化，成功建立了CGSRV的LAMP檢測方法。最佳反應(yīng)溫度為62℃，最佳反應(yīng)時間為40min，反應(yīng)體系為25μL，1μL F3(10μM)，(B3(10μM),(FIP(50μM),(BIP(50μM),3.5μL dNTPs(25mM),4μL10×Thermopol buffer,8U BstDNA聚合酶，3μL MgCl2(

5、25mM)，2μL模板DNA和7.5μL ddH2O。結(jié)果表明，該LAMP方法對CGSRV最低檢測限5 copies/μL，而巢氏PCR和常規(guī)PCR的檢測限為50 copies/μL和5×103copies/μL，表明該LAMP方法的靈敏度顯著高于巢氏PCR和常規(guī)PCR;且特異性強與錦鯉皰疹病毒、金魚皰疹病毒2型、云斑尖塘鱧虹彩病毒、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒、遲鈍愛德華菌、嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等均無交叉反應(yīng)。在對經(jīng)普通PCR與巢氏P

6、CR檢測陽性的55例疑似患蛙病毒感染樣本及8例陰性樣本，采用建立的LAMP技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果與普通PCR及巢氏PCR的檢測結(jié)果一致。再運用以上三種方法對32例疑似樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，LAMP反應(yīng)檢測出30種，檢測率高達93.75％，巢氏PCR檢測出28種，檢測率高達87.5％，普通PCR反應(yīng)檢測出22種，檢測率達68.75％。試驗結(jié)果表明所建立的LAMP檢測大鯢蛙病毒的方法具有靈敏度高、特異性好、檢測耗時短等優(yōu)點，可以作為一種CGSRV