犬瘟熱病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化與犬瘟熱RT-LAMP診斷方法的建立.pdf

1、犬瘟熱(CD)是一種由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬急性傳染病。CDV屬于副粘病毒科的麻疹病毒屬。主要引起犬科、鼬科和浣熊科動物犬瘟熱的發(fā)生，大熊貓和小熊貓等我國珍稀野生動物也不能幸免。伴隨生態(tài)環(huán)境的變化和動物對CDV的適應(yīng)，它的自然感染宿主范圍在不斷擴大，給犬瘟熱的防治帶來新的難題。目前犬瘟熱的防治的方法主要是疫苗接種和及早發(fā)現(xiàn)，及時隔離，因而制備穩(wěn)定、高效的CDV疫苗和建立靈敏、特意的CD診斷方法尤為重要。在本實驗中優(yōu)化犬瘟熱病毒的培

2、養(yǎng)條件和建立反轉(zhuǎn)錄等溫環(huán)介導(dǎo)核酸擴增診斷方法，分別為CDV疫苗制備奠定了基礎(chǔ)和CD診斷建立了新的方法，對犬瘟熱的防治具有重要的意義。
　　 1犬瘟熱病毒細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　 犬瘟熱的疫苗一般使用弱毒病毒，然而現(xiàn)在許多疫苗免疫效果不理想，主要原因是病毒的培養(yǎng)困難，因而培養(yǎng)出穩(wěn)定，高效的病毒對犬瘟熱疫苗制備具有重要意義。本實驗對病毒在細胞上培養(yǎng)的條件作了優(yōu)化，最終通過TCID50檢測確定病毒細胞培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件，結(jié)果顯

3、示:(1)細胞在培養(yǎng)12-18h時接毒，在72-96h時收毒病毒效價最高;(2)病毒培養(yǎng)的溫度在35℃，維持液pH值在7.1-7.3時病毒滴度最高;(3)生長液中血清含量對病毒滴度影響不大，而在維持液中血清含量在0.5％-1％時病毒滴度高于其他血清含量;(4)細胞密度在4×105個/ml細胞效價明顯高于其他兩個細胞密度;(5)在病毒培養(yǎng)的同時添加少量胰酶能明顯提高病毒的滴度，并且胰酶含量在0.8-1.0μg/ml時病毒滴度最高。(6)不

4、同接毒量的細胞生長曲線顯示病毒接毒量在104TCID50/0.1ml，接毒84-96h時收毒得到的病毒效價最高。實驗還對雞胚成纖維細胞和vero細胞培養(yǎng)犬瘟熱病毒的效果做了比較，結(jié)果證明用vero細胞培養(yǎng)犬瘟熱病毒能夠形成更穩(wěn)定的細胞病變(CPE)。
　　 2犬瘟熱反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增（RT-LAMP）診斷方法的建立
　　 根據(jù)GenBank中犬瘟熱病毒H基因保守序列設(shè)計合成了內(nèi)(FIP,BIP)、外(F3，B3)兩

5、對引物，其中外引物擴增片段的大小為247bp。通過對反應(yīng)條件中內(nèi)、外引物的比例、dNTP濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和時間等條件逐一優(yōu)化，成功建立了犬瘟熱病毒的RT-LAMP檢測方法。該方法在60℃下保溫50min即可完成，可檢測至10-1TCID50滴度的病毒，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比靈敏100倍。經(jīng)對犬腺病毒、犬細小病毒、狂犬病毒、犬冠狀病毒同時進行檢測，結(jié)果顯示，本方法具有高度的特異性。由于RT-LAMP檢測技術(shù)在恒溫的條件