致病菌分子分型技術(shù)在食源性疾病暴發(fā)識(shí)別和溯源調(diào)查中的應(yīng)用

1、致病菌分子分型技術(shù)在食源性疾病暴發(fā)識(shí)別與溯源調(diào)查中的應(yīng)用,自貢CDC 微生物檢驗(yàn)所 劉祥,,,,致病菌分子分型技術(shù),2,,,基于實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)作用,1,,2,5,基于實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)的定義,監(jiān)測(cè)是征對(duì)公共衛(wèi)生行動(dòng)，系統(tǒng)而持續(xù)地收集、分析、解釋、反饋公共衛(wèi)生信息 基于實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)是征對(duì)公共衛(wèi)生行動(dòng)，系統(tǒng)而持續(xù)地收集、分析、解釋、反饋實(shí)驗(yàn)室確診病例信息,為什么要開(kāi)展基于實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)？,1、 確定病原體，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的病原體分型

2、 2、 監(jiān)控每種病原體的變化趨勢(shì)時(shí)間趨勢(shì)（例如按照月、季度、年等）針對(duì)特定人群（例如腹瀉患者、嬰幼兒、孕婦等）,為什么要開(kāi)展基于實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)？,3、有助于有目的地制定病原體控制政策及措施4、提供確診病例信息以確定控制措施的有效性,基于實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)系統(tǒng),,,,,公共衛(wèi)生參比實(shí)驗(yàn)室（疾控中心）,衛(wèi)生行政部門(mén),,臨床實(shí)驗(yàn)室1,臨床實(shí)驗(yàn)室2,臨床實(shí)驗(yàn)室3,臨床實(shí)驗(yàn)室4,1、公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分型發(fā)現(xiàn)病例聚集性 2、公

3、共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室必須與流行病學(xué)家分享分型結(jié)果 3、流行病學(xué)通過(guò)調(diào)查聚集性病例發(fā)現(xiàn)暴發(fā),,致病菌表型分型與分子分型的方法對(duì)比,,,1.表型和分子分型各有優(yōu)缺點(diǎn)；對(duì)于罕見(jiàn)血清型菌株，表型可發(fā)揮重要作用2.分子分型的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，各有適用性，聯(lián)合使用是主流3.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果的質(zhì)量保證是任何分析網(wǎng)絡(luò)的最關(guān)鍵部分,為什么要做分子分型？,,,比較分型法 PFGE 核糖體分型 短期傳播 局部區(qū)域暴發(fā)菌株克隆相關(guān)性 文庫(kù)分型法

4、 MLST 核糖體分型 16S rRNA基因測(cè)序 種群進(jìn)化 研究地域性傳播和流行性變遷,并不矛盾，相互補(bǔ)充,綜合手段,重點(diǎn)介紹以下幾種分子分型方法,16S rRNA基因測(cè)序分型 PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型）MLST（多位點(diǎn)測(cè)序分型）,（一） 16S rRNA基因測(cè)序,RNA,mRNAtRNArRNA,mRNA功能：把細(xì)胞核內(nèi)DNA的堿基順序，按照堿基互補(bǔ)的原則，抄錄并轉(zhuǎn)送至細(xì)胞質(zhì),在蛋

5、白質(zhì)合成中用以翻譯成氨基酸的排列順序。tRNA功能:在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過(guò)程中作為各種氨基酸的載體，并將各種氨基酸專呈給mRNA。rRNA ：核蛋白體RNA，與核蛋白共同構(gòu)成核蛋白體，即核糖體。原核生物的rRNA有5s、16s、23s三種；真核生物有18s、5s、5.8s和28s。,核糖體RNA,蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成原核生物核糖體（70S) 小亞基(30S)

6、 大亞基(50S） 小亞基(30S) 16S rRNA(1542個(gè)核苷酸)（PCR擴(kuò)增大小合適） 蛋白質(zhì)(21種）大亞基(50S） rRNA 5S， 120個(gè)核苷酸

7、 23S，2940個(gè)核苷酸 蛋白質(zhì)(31種）,,,,,分子標(biāo)志－16S rRNA,存在于所有原核生物的細(xì)胞中，并執(zhí)行相同的功能保守區(qū)域幾乎與所有種屬的核糖體靶位點(diǎn)結(jié)合異質(zhì)性區(qū)域變異程度不能區(qū)分親緣關(guān)系接近的細(xì)菌具有分子計(jì)時(shí)器的特點(diǎn)，分子序列變

8、化緩慢，能跨越整個(gè)生命進(jìn)化過(guò)程分子中含有進(jìn)化速度不同的區(qū)域，可用于進(jìn)化程度不同的生物之間的系統(tǒng)發(fā)育研究——進(jìn)化樹(shù),,16S rRNA序列分型,16S rRNA基因圖特征,,鏈球菌屬16S rRNA序列分型,（二） 脈沖場(chǎng)電泳技術(shù) （PFGE）,目前分子分型“金標(biāo)準(zhǔn)”敏感、特異、重復(fù)性高、分辨率高征對(duì)整條染色體分型,PFGE,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)菌的染色體,稀有酶切位點(diǎn),限制性內(nèi)切酶消化,電泳,,,,,

9、費(fèi)用：100元/菌株,,,,,,,,,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,Electric Field 1,Electric Field 2,,Switch Time,CHEF,,,,,,,,,,,,,,,,動(dòng)物、肉類(lèi)和人的多重耐藥Newport沙門(mén)菌分離株的PFGE圖譜,,,,,,已開(kāi)展PFGE的菌種,非傷寒沙門(mén)菌傷寒與甲型副傷空腸彎曲菌單增李斯特菌志賀菌大腸桿菌O157霍亂弧菌,腦膜炎奈瑟氏菌

10、布魯氏菌豬鏈球菌鏈球菌,食源性,非食源性,（三）多位點(diǎn)序列測(cè)定（Multi-Locus Sequence Typing，MLST）,分型的基礎(chǔ)：細(xì)菌基因組內(nèi)位于同一位點(diǎn)的看家基因的片段是否存在變異看家基因的測(cè)序不同的等位基因指派一定的數(shù)值，生成等位基因譜 每個(gè)等位基因譜認(rèn)定為一個(gè)序列型（ST） 進(jìn)化樹(shù)確定親緣關(guān)系,MLST,可以用于暴發(fā)調(diào)查種群生物學(xué)分析，特別適合于分離株有足夠時(shí)間進(jìn)行分化的全球流行病學(xué)