結(jié)核診斷骨科科會

1、結(jié)核實(shí)驗(yàn)室快速診斷技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展,結(jié)核實(shí)驗(yàn)室 夏強(qiáng),,,一、簡要介紹,,二、新技術(shù)應(yīng)用,,,,結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室,免疫組,結(jié)核組,分子組,培養(yǎng),藥敏,鏡檢,結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作分工,,,,,,,結(jié)核檢測技術(shù)應(yīng)用,,,液體培養(yǎng)及藥敏（金標(biāo)準(zhǔn)）,MGIT960培養(yǎng)及藥敏,,,BACTEC MGIT 960 全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng),,國內(nèi)對骨關(guān)節(jié)結(jié)核培養(yǎng)陽性率報道不一：14.5%、46.4%、30.1%、42%、83.87%不等骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者

2、一般術(shù)前都經(jīng)過抗結(jié)核藥物治療，A 群為生長旺盛菌群，但易被藥物殺滅，而 B、C、D 群多為休眠或靜止?fàn)顟B(tài)，代謝緩慢。骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本的培養(yǎng)在參照肺結(jié)核痰培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，應(yīng)該適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，建議延長到 8 周左右,,死骨、肉芽、壞死椎間盤、干酪樣壞死等病變組織的培養(yǎng)陽性率（45.45%）略低于膿液及膿血標(biāo)本組（63.83%）。脊柱結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性率（61.40%）略高于髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、骶髂關(guān)節(jié)等其他部位結(jié)核組（

3、41.67%）。第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果表明，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）在分枝桿菌分離株中占 11.1%，牛分枝桿菌占全部分枝桿菌株的 2.5%。NTM 感染無論從臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)，甚至病理學(xué)表現(xiàn)，都與結(jié)核桿菌感染極為相似，很難鑒別，,結(jié)果統(tǒng)計(jì),結(jié)果統(tǒng)計(jì),時間,,例數(shù),,現(xiàn)象：同一耐藥患者在治療的不同階段，藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)生了改變？,1、檢測方法本身的可靠性：藥物的穩(wěn)定性，濃度，菌株的生長狀況。2、耐藥發(fā)生了演變：原發(fā)

4、耐藥和繼發(fā)耐藥3、混合感染問題：感染了多種分枝桿菌,人體對于結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫。 T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用關(guān)系到感染的進(jìn)程和演變。巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后，就會把它們消化成大小不一的片斷。特異片斷(抗原肽)與巨噬細(xì)胞和其他抗原遞呈細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體相結(jié)合，表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，并遞呈給T細(xì)胞。特異性CD4 T細(xì)胞能產(chǎn)生特征性淋巴因子，包括一種能夠刺激T細(xì)胞增殖的IL-2和γ-干擾素。IGRA就是

5、檢測被結(jié)核菌激活的記憶T細(xì)胞釋放出γ-干擾素水平。,2.2 TB-IGRA,APC,T cell,IFNg,,,IGRA應(yīng)用,,,,,2.3 HAIN技術(shù)得到全面認(rèn)可,,HAIN技術(shù),,,,效果評價,,中國疾控中心結(jié)核國家參比實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),,分枝桿菌的分類：一、緩慢生長菌群1．結(jié)核菌群：包括人型結(jié)核桿菌，牛型結(jié)核桿菌，非洲分枝桿菌，田鼠分枝桿菌。2．I 群光產(chǎn)色菌。如：堪薩斯、海分枝桿菌等。3．Ⅱ群暗產(chǎn)色菌。如：瘰癘、戈氏分

6、枝桿菌。4．Ⅲ群不產(chǎn)色菌。如鳥型、胞內(nèi)、潰瘍分枝桿菌等。二、 迅速生長菌即Ⅳ群菌，包括偶發(fā)、龜、恥垢分枝桿菌等。三、需要特殊營養(yǎng)菌包括麻風(fēng)分枝桿菌、鼠麻風(fēng)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌。Runyon分類法中的 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群分枝桿菌又稱為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria ，NTM),,,經(jīng)過了全球四年的觀察，HAIN技術(shù)已經(jīng)是非常成熟的技術(shù)并得到同行的認(rèn)可與好評。Hain 技術(shù)可以在

7、二個工作日檢測RIF和INH的耐藥可以進(jìn)一步分析18種常見非結(jié)核分枝桿菌。缺點(diǎn)：與960液體快速藥敏相比，該方法藥敏結(jié)果具有假陰性可能，占10%左右。這是所有分子診斷技術(shù)的原理缺陷。,2.4 RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（TB-SAT）,DNA和RNA的主要區(qū)別就在糖基。DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，RNA是單螺旋結(jié)構(gòu)DNA很穩(wěn)定，RNA很不穩(wěn)定。,,結(jié)核RNA在細(xì)胞中拷貝數(shù)很多,使用rRNA為靶標(biāo)，大大提高了取樣效率和檢測靈敏度。,,DNA擴(kuò)增技

8、術(shù)（PCR）用于病原體檢驗(yàn)的不足,“死菌檢測也陽性”，與臨床相關(guān)性差 基因與表型不吻合 (耐藥檢測) 不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感性” 交叉污染問題（三個房間） 變溫檢測，對儀器要求高 反應(yīng)抑制問題（Taq酶）,,RNA擴(kuò)增技術(shù)檢驗(yàn)的優(yōu)勢,靈敏度高：RNA 拷貝數(shù)≥ DNA拷貝數(shù)（104 ≥1~6 ）與臨床相關(guān)性好，可以區(qū)分“死菌”“活菌”：病原體死亡，RNA很快降解（=“培養(yǎng)”）

9、 減少無效治療，比如抗生素濫用可以診斷“活動性感染” 活動性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍 潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄不易污染：靶標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNA,,RNA 用于TB的檢測多國診療指南,2009：美國CDC更新NAAT法在TB實(shí)驗(yàn)室診斷中應(yīng)用的指南 ——所有疑似TB的初診病人，除了做涂片之外，都必須用TB-SAT檢測至少一份樣本。（RNA獲得FDA 認(rèn)證可檢測涂陰、涂陽標(biāo)本，DNA只獲得FDA 認(rèn)

10、證可檢測涂陽標(biāo)本）,Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Ampflication Test in the Diagnosis of Tuberculosis (2009) United States,,,目前，我實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)275例，靈敏度達(dá)到93%，特異性達(dá)到85%.該方法只適合痰標(biāo)本,2.5結(jié)核抗體lgG、lgM,,,,2.6 Gene Xpert,,,,,,,缺點(diǎn)：