循環(huán)腫瘤細(xì)胞ctc檢測(cè)在肺癌中應(yīng)用

1、,循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè)在肺癌中的應(yīng)用,腫瘤疾病近期療效的判斷方法,臨床因子作為預(yù)后與預(yù)測(cè)因子,預(yù)后：T, N, M staging, PS score預(yù)測(cè)：吸煙狀況：指導(dǎo)靶向治療性別：指導(dǎo)靶向治療種族：指導(dǎo)靶向治療組織學(xué)：指導(dǎo)化療和靶向治療,影像學(xué)方法,非侵入地、直觀地對(duì)患者的腫瘤大小變化情況進(jìn)行評(píng)估。 缺點(diǎn)：存在一定的健康危害或健康隱患腫瘤大小常與腫瘤的惡性程度或浸潤(rùn)能力不完全一致費(fèi)用昂貴 滯后性靈敏性低

2、,病理學(xué)方法,手術(shù)或活檢獲得病灶組織/周圍淋巴結(jié)組織，進(jìn)行病理學(xué)染色和分析，是目前唯一明確腫瘤有否轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)缺點(diǎn)：精確度不夠高 是侵入性檢查手段易造成擴(kuò)散 人工誤差大難以標(biāo)準(zhǔn)化,血清腫瘤標(biāo)記物測(cè)定,血清腫瘤標(biāo)志物的濃度往往可以在一定程度上提示腫瘤的發(fā)展程度缺點(diǎn)：特異性不高 易受非特異蛋白的干擾 其他的病理生理狀態(tài)影響導(dǎo)致假陽(yáng)/陰性結(jié)果,1869年 Aust Med J，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀

3、察到。2005年 N Engl J Med，Cristofanilli證實(shí)治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實(shí)體瘤中脫離出來(lái)并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞,CTC檢測(cè),預(yù)測(cè)PFS及OS 指示預(yù)后效果 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)與分期有助于腫瘤個(gè)體化治療的藥物篩選和治療方案的確定是傳統(tǒng)的影像學(xué)及其他生物標(biāo)志物的補(bǔ)充檢測(cè)手段有助于尋找新的腫瘤標(biāo)識(shí)物以及開發(fā)新的抗腫瘤藥物

4、,腫瘤細(xì)胞作為生物標(biāo)志物,外周血和肺靜脈血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）臨床意義:轉(zhuǎn)移的輔助標(biāo)志物？可以預(yù)測(cè)治療？預(yù)后因子？最小損傷的突變檢測(cè)?,獲取CTC需要解決的技術(shù)問(wèn)題,從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來(lái),每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個(gè)，紅細(xì)胞有500億個(gè)。,三種技術(shù),過(guò)濾法,ISET: Is

5、olation by Size of Epithelial Tumor cells8μm孔徑過(guò)濾膜，漏檢體積較小的腫瘤細(xì)胞敏感性低,梯度密度法,腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于1.077g/mlCTC純度低，混入較多白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞會(huì)遷移至血漿層，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對(duì)細(xì)胞有毒性,免疫磁珠法,腫瘤細(xì)胞表面抗原CTC純度低，混入較多白細(xì)胞不能有效排除細(xì)胞碎片假陽(yáng)性和假陰性高,Cell S

6、earch---免疫磁珠+流式細(xì)胞分析+化學(xué)發(fā)光,CellSearch 是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）產(chǎn)品,1983 磁流體,J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63. Epub 2011 Mar 21.Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients w

7、ith non-small-cell lung cancer.,背景,實(shí)驗(yàn)流程,,,,,患者入組標(biāo)準(zhǔn),未做過(guò)化療，且4周內(nèi)未做過(guò)放療病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌IIIA, IIIB, IV期準(zhǔn)備進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒療法5年內(nèi)未患過(guò)惡性腫瘤,實(shí)驗(yàn)方法,CellSave 專用收集管采集血液采集血后于室溫儲(chǔ)存并于96小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)Cellsearch 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),患者化療前CTC數(shù)量（基線CTC）與臨床特征的關(guān)系,IV期患者CTC數(shù)量明

8、顯多于IIIB期患者， IIIB期患者的CTC數(shù)量又明顯多于IIIA期患者。,肝轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移患者中CTC數(shù)量明顯多于其它轉(zhuǎn)移患者。,患者化療前CTC數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移地點(diǎn)的關(guān)系,所有非小細(xì)胞肺癌病人,所有Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌病人,基線CTC數(shù)量與無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的關(guān)系,基線CTC數(shù)量少于5的患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯高于基線CTC數(shù)量大于等于5的患者。,化療前后CTC數(shù)量與患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的關(guān)系,化療后CTC數(shù)量少于5的患者

9、無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯高于CTC數(shù)量大于5的患者?；熐昂驝TC數(shù)量都少于5 的患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯高于只有一次測(cè)出CTC數(shù)量少于5的患者。,化療前后CTC的數(shù)量變化反映臨床療效,化療前,化療后,化療后CTC數(shù)量減少患者的臨床療效好于CTC數(shù)量增加的患者,,結(jié) 論,CTC能在IV期非小細(xì)胞肺癌患者中檢出,CTC數(shù)量的變化反映了臨床療效,CTC數(shù)量與OS 和PFS相關(guān)，是非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)新的預(yù)后判斷因子,,,,

10、CTC在判斷是否存在轉(zhuǎn)移中有重要參考價(jià)值,對(duì)于原發(fā)性肺癌患者，CTC計(jì)數(shù)在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者中有顯著升高，相關(guān)性優(yōu)于CEA。,CTC升高對(duì)于判斷遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的敏感性達(dá)71%，特異性達(dá)83%,CTC計(jì)數(shù)和血清CEA水平在不同切點(diǎn)的診斷價(jià)值,治療前和治療后CTC的數(shù)量變化反映療效,大多數(shù)患者的CTC數(shù)量在第一個(gè)化療療程后（22天）下降，提示療效好。,The Annals of Thoracic Surgery Volume 87,Issue

11、6,June 2009, Pages 1669-1675 Circulating Tumor Cells in Pulmonary Venous Blood of Primary Lung Cancer Patients,鱗癌中periCTC和pvCTC的數(shù)量明顯高于腺癌,N Engl J Med 2008;359:366-77.Detection of Mutations in EGFR in Circulating Lun

12、g-Cancer Cells,背景,CTC中EGFR突變與腫瘤組織中EGFR突變的一致性（SARMS方法）,CTC中EGFR基因型有17個(gè)與腫瘤組織中的一樣，準(zhǔn)確率為94%，,CTC數(shù)量與病情進(jìn)展的關(guān)系,吉非替尼治療后CTC數(shù)量下降，伴隨著疾病進(jìn)展CTC數(shù)量也隨之上升。腫瘤大的患者CTC數(shù)量比腫瘤小的患者多。,CTC數(shù)量,影像學(xué)腫瘤變化,檢測(cè)CTC中EGFR的基因型與組織中檢測(cè)結(jié)果高度符合,可以通過(guò)CTC來(lái)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤的基

13、因型,CTC數(shù)量與疾病進(jìn)展密切相關(guān),,,,,結(jié) 論,小細(xì)胞肺癌患者活檢組織及相對(duì)應(yīng)的CTC中的CD56,活檢組織中的CD56和CTC中的CD56表達(dá)具有一致性,肺癌組織,肺癌肝轉(zhuǎn)移組織,Baseline blood CAC,腫瘤細(xì)胞,a, monosomy 6p11-q12;b, amplification EGFR, c-MYC; EGFR (red) 5.p15.3 (green),6p11-q12 (aqua), c

14、-MYC (yellow).c, trisomy CEP3 and monosomy CEP17; d, polysomy CEP3, CEP7,CEP17 and 9p21.3. CEP3 (red),CEP7 (green), CEP17 (aqua),9p21.3 (yellow).,外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞的異常情況與手術(shù)切除的腫瘤細(xì)胞具有高度一致性。,Baseline blood CTC,腫瘤細(xì)胞,,CTC中的染色體異常分

15、子標(biāo)記物與疾病的復(fù)發(fā)和生存密切相關(guān),,CTC的應(yīng)用：從細(xì)胞計(jì)數(shù)到分子特性,FISH分析CTC生物學(xué)特性,白細(xì)胞有兩份CEP7（綠色），EGFR（紅色）和MET (藍(lán)色) CTC中， EGFR （紅色）和MET (藍(lán)色)基因擴(kuò)增,微列陣,實(shí)時(shí)定量RT-PCR,對(duì)CTC進(jìn)行基因表達(dá)分析,BIOTECAN寶藤——J&J強(qiáng)生,國(guó)內(nèi)首個(gè)CELLSEARCH商業(yè)實(shí)驗(yàn)室CH商業(yè)實(shí)驗(yàn)室,CTC檢測(cè)樣本準(zhǔn)備：,使用CellSave儲(chǔ)存管采集靜

16、脈血液標(biāo)本10ml輕輕顛倒8次，防止凝塊 樣本室溫條件(15-30攝氏度)下96小時(shí)之內(nèi)接受處理接受阿霉素治療的患者給藥之后，至少需要等待7天,樣本溶血及結(jié)塊不能用于CTC檢測(cè)！,NOTICE,樣本處理流程：,7.5ml血液采集于CellSave儲(chǔ)存管，加入6.5ml緩沖液離心CellTracks®AutoPrep®系統(tǒng)自動(dòng)處理流程系統(tǒng)自動(dòng)將被捕獲的、經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞置入MagNest裝置的樣本盒中