真菌檢測的臨床意義

1、真菌檢測的臨床意義,真菌感染的分類,根據(jù)真菌侵犯人體的部位分為四類：淺表真菌病皮膚真菌病 皮下組織真菌病系統(tǒng)性真菌病,,,,,淺部真菌病,深部真菌病,深部真菌感染,深部真菌感染是一種重癥感染，死亡率為40-90%真菌病的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其對重癥監(jiān)護病房和免疫缺陷患者、以及癌癥患者，8%的院內(nèi)感染由真菌引起白色假絲酵母、熱帶假絲酵母、光滑假絲酵母、隱球菌等是最常見的感染病原菌真菌感染的早期診斷、盡早開始治療，

2、是挽救患者生命的最重要的手段,Company Logo,4,近年深部真菌變遷的特點,念珠菌血癥：白色念珠菌為主呈下降趨勢 非白念：光滑念珠菌，近平滑念珠菌和熱帶念珠菌，克柔念珠菌呈上升趨勢 隱球菌、曲菌的比例上升。死亡率增加 不同科室的病人發(fā)生感染的真菌不同,同一個體內(nèi)可能發(fā)生兩種或兩種以上的真菌感染 產(chǎn)生對氟康唑、兩性霉素B的耐藥菌株,并有增加的趨勢,,近年來，非白色念珠菌的分離率有所上升,全球ARTEMIS Disk研究結(jié)果

3、顯示：1997-2003年非白色念珠菌分離率有所升高,分離率(%),MA Pfaller, et al. J Clin Microbiology. 2005:5848-5859.,侵襲性肺真菌感染的流行病學(xué)2005年南京軍區(qū)總醫(yī)院30例：曲霉31%，白念24%，光滑念17%，熱帶念13%，新生隱球菌、克柔念及近平滑念各3%2002～2006年北京協(xié)和醫(yī)院152例肺真菌感染中確診38例：曲霉39.5%，隱球菌34.2% 、毛霉10.

4、5%，念珠菌僅5.3%總之，目前仍以念珠菌感染為主，但發(fā)病呈下降趨勢，白念減少，克柔念和光滑念增多；曲霉比例逐年增高，可能成為主要病原菌存在爭議，主要因診斷標(biāo)準不同，國外以組織病理學(xué)或組織培養(yǎng)為確診依據(jù)，我國以痰或BALF培養(yǎng)為依據(jù),住院時間長 高敏感性 糖尿病 腎衰竭 血液透析 急性胰腺炎 廣譜抗生素的使用 中心靜脈導(dǎo)管 癌癥和化療 腸外營養(yǎng) 外科手術(shù) 移植 服用免疫抑制劑

5、 多處念珠菌定植,ICU中發(fā)生侵襲性念珠菌病的危險因素,Luis Ostrosky-ZeichnerCrit Care Med 2006; 34:857–863,ICU患者念珠菌血癥的高危因素,一項10年(1990-2000)的回顧性薈萃分析,患者比例(%),Charles PE et al. Intensive Care Med. 2003;29:2162-2169.,臨床常見的條件性真菌感染,念珠菌病: 最常見，血源感染的第4位。

6、曲霉菌病: 常見于干細胞移植、實體器官移植、大劑量化療患者和免疫缺陷患者。隱球菌病: 艾滋病人患病率為10-20%。 接合菌病（毛霉?。?多見于重癥糖尿病、燒傷病及器官移植病人。,臨床有增多趨勢的條件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染鐮刀菌感染枝頂孢霉感染暗色真菌感染馬爾尼菲青霉:目前已成為HIV陽性患者的主要條件致病菌,Company Logo,真菌感染的實驗室鑒定方法,形態(tài)學(xué)檢查培養(yǎng)+鑒定血清學(xué)檢查

7、分子生物學(xué)檢查其它：組織病理學(xué)，影像學(xué),真菌直接涂片的診斷價值,診斷陽性率高BALF培養(yǎng)陽性率40％，涂片64％，涂片＋培養(yǎng)67％(Ann Intern Med 1997, 29: 535; Respir Med 1992, 86:243)快速:2-4h可以報告結(jié)果：直接鏡檢，G染色，墨汁染色 有助于鑒別感染類型是真菌絲還是假菌絲有隔菌絲：曲霉菌屬唑類抗真菌藥（伊曲康唑、伏立康唑）有效無隔菌絲： 根毛霉屬、根霉屬、

8、毛霉屬、犁頭霉屬、小克銀漢霉屬 兩性霉素B敏感,,The lancet, 2003, 3: 230-240,馬xx，右下支氣管黃曲霉,支氣管液,Mucor species - Microscopic Morphology, 400x Lactophenol cotton blue 大型孢子囊,無囊托,無匍 菌絲及假根,真菌培養(yǎng),結(jié)果可靠可進行分類鑒定到種，可進行藥敏試驗無菌部位分離出任何菌株，在未得到可靠證據(jù)證明其污染時

9、，不應(yīng)確診為污染。有菌部位來源標(biāo)本經(jīng)兩次或以上培養(yǎng)為同一結(jié)果時，可初步判斷為感染菌。,真菌的血清學(xué)檢測,真菌細胞壁的成分 1,3- β- D葡聚糖（G試驗）:應(yīng)用范圍：曲霉菌、念珠菌、鐮刀霉、 毛孢子菌、 (隱球菌、毛霉菌除外)真菌抗原 半乳甘露聚糖抗原（GM試驗） 甘露聚糖抗原 新型隱球菌的莢膜多糖抗原真菌特異性代

10、謝產(chǎn)物 D-阿拉伯糖醇,真菌血清學(xué)檢測方法優(yōu)缺點,優(yōu)點：報告結(jié)果快速敏感性高取樣方便定量檢測可判斷感染嚴重程度及療效評估缺點：特異性不高,真菌的分子生物學(xué)檢測方法,PCR方法：一步法PCR、巢式PCR菌種：念珠菌、隱球菌、曲霉菌,重要醫(yī)學(xué)酵母菌分類,醫(yī)學(xué)重要的霉菌分類,1. 監(jiān)測真菌耐藥趨勢2. 為臨床選擇敏感的抗真菌藥物3. 為合理用藥提供快速有效的依據(jù)4. 并有助于臨床真菌感染的管理,

11、真菌藥敏試驗的臨床意義,抗真菌藥物體外敏感試驗,1.液體稀釋法 CLSI M27A2：致病性酵母菌 CLSI M38A： 產(chǎn)孢絲狀真菌2.瓊脂稀釋法3.紙片擴散法—— CLSI M44-A Roscoe紙片4.E－test法,判讀難點,拖尾生長在唑類藥物孔中的微弱生長 (得分 = 1 或 2) 導(dǎo)

12、致對 MIC值高估可能被誤判為耐藥,,,Control,例如: 在如下所有氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑 孔中都有拖尾生長,1 2 4 8 0.125 0.25 0.5 0.06 0.125 0.25 0.5,16 32 64 128 1 2 4 1 2 4 8,F

13、CA ITR VRC,,,FUNGUS-3的結(jié)果判讀,對于兩性霉素B，最小抑菌濃度（MIC）是得分為“0”時的濃度；對于氟康唑（FCA）, 伊曲康唑（ITR）和 伏立康唑（VRC），鑒于可能存在拖尾生長，最小抑菌濃度（MIC）為 得分為“2”，“1”，或是“0”分時的濃度。,,氟康唑, 伊曲康唑, 伏立康唑 :MIC值為得分為“2, 1 或 0”的最小濃度,1 2

14、 4 8,,32 64 128,FCA,判讀 唑類 結(jié)果,肉眼判讀,E-test方法可適合多種真菌的藥敏測試，如念珠菌、隱球菌、曲霉菌、鐮刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨頭霉、外瓶霉、帚霉等,E-test檢測曲霉MIC,E-test檢測念株菌MIC,真菌 E-test 法,紙片擴散法——CLSI M44-A,A,B,,,什么情況下需做體外藥敏試驗,建議在下列情況下：1、分離菌株來自血源性感染或其他無菌部位2、病原為非白念珠菌

15、特別是光滑或克柔念珠菌或者其他霉菌3、抗真菌治療療效不佳4、擬采用唑類藥物進行抗真菌治療,微生物室如何選擇真菌藥敏試驗,1. 常量稀釋法：盡管對真菌藥敏試驗的標(biāo)準化起推動作用 但日常工作中難推廣2. CLSI紙片法：單個藥敏意義不大3. ATB FUNGUS 3 做真菌藥敏試驗較為可行。 且ATB FUNGUS 3 能提供MIC值。4. 臨床寄希望將來推行Etest 法 其是一個很有應(yīng)用前

16、景的臨床實驗室抗真菌藥敏試驗方法。,對 假絲酵母菌屬 的結(jié)果解釋,CLSI 折點:,目前沒有官方推薦，文獻提供如下信息,對 新型隱球菌 的結(jié)果解釋,多烯類：兩性霉素B、制霉菌素（與麥角固醇結(jié)合）非多烯類：灰黃霉素唑類藥物： 1.三唑類藥物: 氟康唑、伊曲康唑（抑制麥角固醇合成） 2.咪唑類：酮康唑丙烯胺類 : 特比萘芬（抑制乙酰輔酶A）合成抗真菌藥物: 5-氟胞嘧啶（阻斷核酸合成）新型抗真菌藥物

17、 1.第二代三唑類藥物 : 伏立康唑 、泊沙康唑 2.棘白菌素類: 卡泊芬凈、米卡芬凈（抑制葡聚糖合成） 3.尼可霉素Z （抑制甲殼質(zhì)合成） 4.普拉米星和貝拉米星（抑制甘露聚糖蛋白）,臨床常用的抗真菌藥物,37th熱病：抗真菌藥物活性,—無活性；+/—可能有活性； +有活性，三線（至少臨床有效）++有活性，二線（作用稍差）；+++有活性，一線（常常有效）,37th熱?。嚎拐婢?/p>

18、物活性,,—無活性；+/—可能有活性； +有活性，三線（至少臨床有效）++有活性，二線（作用稍差）；+++有活性，一線（常常有效）,1997-2005 ARTEMIS念珠菌對氟康唑耐藥率變遷,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,2001-2005 ARTEMIS念珠菌對伏立康唑耐藥率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,白色 0.8

19、 0.8 1.5 1.0 1.5 1.4 1.6 1.6 1.5光滑 18.5 22.8 14.3 18.3 14.7 16.9 14.3 15.2 15.8熱帶 4.2 3.5 3.1

20、 3.0 6.6 5.0 3.5 3.8 4.4近平滑 2.0 2.8 2.9 4.2 3.9 3.0 3.3 4.2 3.6克柔 56.5 71.5 68.1 70.4 7

21、8.9 80.2 78.1 79.2 77.8,體外研究中念珠菌對氟康唑的耐藥情況,白色、熱帶、近平滑念珠菌對氟康唑的敏感性仍較好，但是光滑和克柔的耐藥率高。,97-98 99 00 01 02 03 04 05 總計,Pfaller. J Clin Microbiol 2005Pfaller

22、. J Clin Microbiol 2007,1997-2007 ARTEMIS非念珠酵母菌氟康唑耐藥率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,1997-2007 ARTEMIS非念珠酵母菌伏立康唑耐藥率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,,,,,酵母菌敏感性小結(jié),大多數(shù)酵母菌對氟康唑敏感性>90%克柔念珠菌對氟康唑類天然耐藥，紅酵母屬氟康唑耐藥率約50%光滑念

23、珠菌耐藥率在10~20%,另有~10% SDD分離自不同標(biāo)本的念珠菌，敏感性無明顯差異MIC不能完全預(yù)測臨床療效, 但是Dose／MIC＞25時臨床有效率91~99%念珠菌出現(xiàn)繼發(fā)感染，患者之前用過三唑類可能耐藥真菌藥敏報告提示：“真菌藥敏試驗結(jié)果僅供臨床參考”,771株曲霉唑類敏感性,Pfaller MA, et al. JCM. 08: 2568,Hope試驗,aspergillus,煙曲霉,黃曲霉,黑曲霉,土曲霉,構(gòu)巢曲霉

24、,,,,37th熱?。嚎拐婢幬锘钚?,—無活性；+/—可能有活性； +有活性，三線（至少臨床有效）++有活性，二線（作用稍差）；+++有活性，一線（常常有效）,37th熱?。嚎拐婢幬锘钚?,—無活性；+/—可能有活性； +有活性，三線（至少臨床有效）++有活性，二線（作用稍差）；+++有活性，一線（常常有效）,絲狀真菌敏感性小結(jié),煙曲霉：極少有耐藥株黃曲霉：兩性霉素B的MICs較高黑曲霉: 伊曲康唑有耐藥菌

25、株土曲霉：兩性霉素B耐藥接合菌: 兩性霉素B脂質(zhì)體對活性較高接合菌、某些曲霉、暗色真菌：手術(shù)切除病灶嚴重免疫抑制/低下者，治療成功需要免疫重建結(jié)合CT、GM、G試驗等早期診斷，早期治療,,體外藥敏試驗與臨床療效的相關(guān)性,念珠菌仍是目前臨床最常見的致病真菌,In vitro Susceptibility of Invasive Isolates of Candida spp. To Anidulafungin. Caspof

26、ungin, and Micafungin:Six Years of Global SurveillanceJOURNAL OF CLINICAL MICROBLOLOGY.JAN.2008.150-156,念珠菌感染具有很高的發(fā)病率及死亡率,院內(nèi)血流感染前4位病原體的分布和死亡率,百分比(%),凝固酶陰性葡萄球菌,金黃色葡萄球菌,腸球菌,念珠菌,2. Wisplinghoff H et al. Clin Infect Dis. 2

27、003;36:1103-1110.,818/2711,311/2711,230/2711,315/2711,185/553,52/245,84/188,61/228,自1995年至2001年由美國49所醫(yī)院對2340例院內(nèi)血流感染患者進行的一項大型前瞻性研究，分析研究院內(nèi)血流感染最常見的致病菌及其藥物敏感性。,早期治療侵襲性念珠菌感染可降低患者死亡率,11.1％,<12小時,12-24小時,24-48小時,>48小時,一項對

28、念珠菌血流感染患者進行的回顧性研究結(jié)果,院內(nèi)死亡率(％),*自首次陽性血培養(yǎng)的血標(biāo)本采集后開始計時一項自2001年至2004年對157例念珠菌血流感染患者進行的回顧性、隊列研究，比較分析開始抗真菌治療時間與患者死亡率的關(guān)系。,4. Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3640-3645.,12*小時后平均死亡率為33.1%,P=0.169,早期使用大扶康®

29、;可顯著降低患者死亡率,12. Kevin W. et al. Clin Infect Dis. 2006; 43:25–31.,死亡率(%),P=0.0009,采集血培養(yǎng)當(dāng)天*,采集血培養(yǎng)后1天*,采集血培養(yǎng)后2天*,采集血培養(yǎng)后≥3天*,一項4所醫(yī)學(xué)中心對230例念珠菌血癥患者進行的回顧性隊列研究結(jié)果,采集血培養(yǎng)后≥3天開始使用大扶康抗真菌治療，患者死亡率高達41.4%,41.4%,*自首次陽性血培養(yǎng)的血標(biāo)本采集后開始計時自200

30、2年1月至2005年1月，由美國4所醫(yī)學(xué)中心參加的回顧性隊列研究，分析230例念珠菌血癥患者開始氟康唑治療的時間與死亡率的關(guān)系。,治療念珠菌感染——2009 IDSA念珠菌病治療指南,Pappas PG et al. Clinical Infectious Diseases 2009; 48:503-35.,bid：每日2次,治療念珠菌感染——其他國際權(quán)威指南,1. Gilbert DN, et al. The Sanford Guid

31、e to Antimicrobial Therapy 2009,,iv：靜脈滴注；po：口服給藥；qd：每天1次；bid：每天2次。,39版《熱病》1,2008 The Medical Letter指南2,2. Treatment Guidelines from The Medical Letter 2008; 65(6).,歐洲系統(tǒng)性真菌感染臨床指南(第三版)3,3. Malcolm D Richardson, Brian L Jon

32、es. Therapeutic Guidelines Systemic Fungal Infections. Third Edition. Current Medical Literature.,,,,體外抗真菌藥敏試驗與體內(nèi)療效,CLSI M27-A 600余株念珠菌MIC值：分離自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治療失敗者，MIC值大于64 µg/ml“90-60原則”—MIC值與臨床療效 藥

33、敏試驗敏感菌株：90%對治療有效 藥敏試驗?zāi)退幘辏?0%對治療有效 Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989,氟康唑敏感性vs.臨床有效率,Pfaller MA, et al. CMR. 06: 435.,在臨床應(yīng)用中，常按日劑量與MIC比值大于50的劑量用于嚴重真菌感染，日劑量與MIC值比值為25的劑量用于一般真菌感染含MIC的真

34、菌藥敏報告對臨床治療更有價值以FCZ為例：,,Hopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160,體外抗真菌藥敏試驗與體內(nèi)療效,氟康唑敏感性vs.臨床有效率,Pfaller MA, et al. CMR. 06: 435.,Dose/MIC(提示AUC/MIC)>25,臨床有效率91～99%Dose/MIC <25,治療失敗率26～35%,總 結(jié)：,真菌

35、在臨床上感染發(fā)生的幾率越來越高。臨床上對真菌的檢測必要時可采用多種方法聯(lián)合檢測以提高陽性率，但培養(yǎng)最重要，不但可以鑒定到種，而且可以進行藥敏試驗?？傮w來說，真菌的耐藥沒有細菌嚴重，對大多數(shù)抗真菌藥物敏感性均較高。但念珠菌中應(yīng)注意克柔和光滑念珠菌的耐藥性，棘白霉素類不能用于隱球菌感染治療，絲狀真菌應(yīng)區(qū)分曲霉菌和非曲霉菌的治療。微生物室真菌藥敏報告可能與臨床療效存在一定的差別，但藥物的MIC值對治療藥物劑量的選擇有幫助。大扶康