流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用技巧

1、利用流式細(xì)胞儀( flow cytometer ) 通過檢測熒光信號來檢測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過這些特性對細(xì)胞或顆粒進(jìn)行定量。 & 檢測表面標(biāo)記物 & 檢測胞漿標(biāo)記物 & 檢測胞核內(nèi)標(biāo)記物 & 檢測可溶性蛋白,流式細(xì)胞術(shù)（FLOW CYT

2、OMETRY）,一、流式細(xì)胞儀的原理——應(yīng)用技巧的基礎(chǔ),1、儀器的基本原理,光源：激光(488nm 氬離子空冷激光) 細(xì)胞： 單細(xì)胞懸液 液流：鞘液(Sheath Fluid) 流動(dòng)室：Flow Cell檢測器：光電倍增管(PMT)檢測信號：散射光(FS，SS)，熒光信號(FL1~FL4)統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)算機(jī),散射

3、光信號 FS 細(xì)胞大小 SS 細(xì)胞顆粒性熒光信號 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 FL5 - PC7,用熒光標(biāo)記抗體,抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對應(yīng)的抗原,表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng),,陽性細(xì)胞百分比或濃度,靶蛋白濃度,,,,,,,2、標(biāo)本處理原理（標(biāo)記原理）,（1）、直標(biāo)和間標(biāo)（2）、細(xì)胞膜標(biāo)和細(xì)胞

4、內(nèi)標(biāo)（3）、兩種染色：抗體和染料（4）、組合標(biāo)記,間接免疫熒光標(biāo)記法,直接免疫熒光標(biāo)記法,抗原分布:Important for method optimization,表面，胞漿，核內(nèi)是共同檢測還是分別檢測？,CD3,4,8, tetramer+Cytokines,CD3,4,8, tetramer+DNA,Cytokines+DNA,CD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNA,,Intr

5、acellular Cytokine-Protocol,,2、提供的信息,（1）、方案：兩種圖形（散點(diǎn)圖、直方圖）（2）、百分率信息、強(qiáng)度信息（3）、分群：細(xì)胞大小（FS）細(xì)胞內(nèi)顆粒（SS）（4）、設(shè)閾值、設(shè)門特征（細(xì)分）（5）、直接信息、間接信息,二、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧一,整合項(xiàng)目，樹立體系化概念，提高流式使用價(jià)值,白血病全過程評價(jià),,,患者出現(xiàn)癥狀,各種抗原（參照白血病抗原選擇原則）,診斷白血病，確診疾病，對白血病進(jìn)行分型

6、以指導(dǎo)治療,治療,初診時(shí)所用抗原中能夠代表白血病細(xì)胞的特殊抗原,評價(jià)療效及治療的療程,同上,緩解期,動(dòng)態(tài)跟蹤患者緩解期的白血病細(xì)胞變化，及時(shí)控制在相應(yīng)水平下,臨床過程,FCM檢測項(xiàng)目,意義,,,,,,,,,,,,,,,,,CIK細(xì)胞治療過程的評價(jià),,,治療前病人免疫狀況評價(jià),T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子,是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做CIK,采集MNC,MNC數(shù)目、純度、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例,是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù),

7、MNC數(shù)目、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況,培養(yǎng),培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時(shí)機(jī),回輸后,T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子,療效評價(jià)、監(jiān)測、下次治療的時(shí)機(jī),CIK治療程序,FCM檢測項(xiàng)目,意義,,,,,,,,,,,,,,,,,,,腫瘤細(xì)胞免疫特點(diǎn),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,AIDS全過程免疫細(xì)胞評價(jià),,,基礎(chǔ)免疫水平,T亞群、NK、CIK,當(dāng)?shù)夭煌挲g、性別、民族的免疫水平基礎(chǔ)數(shù)據(jù),

8、高危人群—HIV檢測陽性,T亞群、NK、CIK、 CD4凋亡、細(xì)胞因子,HIV檢測陽性前的免疫水平變化狀況及CD4的凋亡,T亞群、NK、CIK 、CD3、CD4、CD8活化狀況、細(xì)胞因子、CD4凋亡,HIV陽性—AIDS,檢出HIV到發(fā)病的情況,AIDS病人治療,T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子、CD4凋亡、 CD3、CD4、CD8活化狀況,療效評價(jià)、監(jiān)測、治療效果及病情動(dòng)態(tài)觀察,AIDS過程,FCM檢測項(xiàng)目,意義,,,,,,,,,,,,

9、,,,,骨髓移植或CD34細(xì)胞移植,,動(dòng)員,采 集,PBSC的凍存,解凍和回輸,回輸后免疫功能的監(jiān)測,并發(fā)癥,,,,,,三、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧二,利用儀器的靈活性，充分整合項(xiàng)目,1、CIK細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞的凋亡分析2、不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、表達(dá)情況3、不同分型增殖的細(xì)胞分布4、sp細(xì)胞、非sp細(xì)胞,5、腫瘤細(xì)胞診斷時(shí) （1）、胸腹水：把白細(xì)胞和癌細(xì)胞分開 （2）、穿刺，手術(shù)細(xì)胞：,6、組織中的浸潤細(xì)胞：7、Th1/T

10、h2細(xì)胞的分析,四、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧三,利用儀器提供的參數(shù)，對所做實(shí)驗(yàn)全面分析評價(jià),1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中： 轉(zhuǎn)染率 疫苗 轉(zhuǎn)染的強(qiáng)度2、同時(shí)分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強(qiáng)度3、稀有細(xì)胞的額外發(fā)現(xiàn)： T亞期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK細(xì)胞：CD3-CD16+56+ CD3+C

11、D16+56+4、Tunecl方法中 不同周期的凋亡狀況 細(xì)胞阻滯狀況 DNA斷片發(fā)生時(shí)SOS狀況,,,,,五、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧四,了解相關(guān)知識(shí)及現(xiàn)有的評價(jià)方法，充分應(yīng)用流式細(xì)胞,,1. 白血病分型 形態(tài)學(xué)、免疫組化、PCR2. 細(xì)胞因子 生物活性測定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子檢測法——FCM、

12、 ELI-SPOT、FCM（STAT）3. HLA B27/B7 FCM、免疫法4. 凋亡、蛋白表達(dá) FCM、免疫組化、PCR5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等,熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙/溴化乙啶染色,SGC-7901細(xì)胞24h,SGC-7901蒿甲醚組24 h,SGC-7901 DDP組24h,ECV-304細(xì)胞 24h,ECV-304蒿甲醚組24h,ECV-304

13、 DDP組24 h,六、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧五,專項(xiàng)應(yīng)用中的問題及解決方案,免疫細(xì)胞相對絕對計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞和其他稀有細(xì)胞的檢測血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測DNA倍體分析，周期、異倍體分析細(xì)胞內(nèi)因子（Th1/Th2）細(xì)胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）各種凋亡檢測（Apo.2.7 Tunecl、DNA亞二倍體）組織中免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（如CXCR、CCR）基因蛋白檢測（如p53、Bcl-2等）白血病免疫分型B27檢測動(dòng)

14、物檢測過程中的問題,免疫細(xì)胞的檢測,T細(xì)胞 分群標(biāo)志 活化標(biāo)志 亞群標(biāo)志B細(xì)胞NK細(xì)胞CIK細(xì)胞以T細(xì)胞亞群檢測為例，其余的免疫細(xì)胞出現(xiàn)的問題類似,1、標(biāo)準(zhǔn)方案 抗 凝 血 組 織 胸腹水、

15、灌洗液（單細(xì)胞懸液）,加入1ml 溶血素（NH4Cl或C液或A、B、C液）,上機(jī)檢測,結(jié)果：CD3+ T Cell ：%、Abs CD4+ T Cell ：%、Abs CD8+ T Cell ：%、Abs,,CD4/ CD8比值,,,,2hr內(nèi)加入 100ul Flow Count,（100ul/份） + 10ul 抗體標(biāo)本標(biāo)記 15-30 min,2、可能的問題及解決辦法（1）、標(biāo)

16、本環(huán)節(jié) 抗凝血： A、抗凝效果不好：如果沒有大的凝血塊，該血可以使 用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時(shí)最好采用Fl1 （CD45所在）;如果有大的凝血塊，不能用于檢測。 B、標(biāo)本在4℃或以下放置過：一般不做檢測用。 C、標(biāo)本放置時(shí)間大于48小時(shí)：檢測時(shí)盡量用Fl1設(shè)閾值。 建議：最好使用新鮮標(biāo)本檢測，尤其是做絕對計(jì)數(shù)時(shí)。 D、動(dòng)物血：對于豬、猴、

17、兔、狗等大動(dòng)物的，如人一樣 處理。而如小白鼠等小動(dòng)物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加樣處理。如需做絕對計(jì)數(shù)，則要求計(jì)算 稀釋倍數(shù)，比如10ul血加入490ul溶血素相當(dāng)于稀釋了 350倍。,2、可能的問題及解決辦法組織標(biāo)本： 組織標(biāo)本做免疫細(xì)胞時(shí)，通常需要CD45設(shè)行，這樣可排 除非血細(xì)胞。A、組織標(biāo)本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：這樣可以減少組織細(xì)胞的量。

18、B、穿刺細(xì)胞：手術(shù)標(biāo)本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，否則會(huì)影響檢測結(jié)果。C、組織標(biāo)本一般保存在生理鹽水中。,2、可能的問題及解決辦法胸腹水、灌洗液： 通常也需要CD45設(shè)門A、都需要濃縮處理：一般取250ml左右，靜置4hr后取沉淀物離心。B、如果需要計(jì)數(shù)，則需做體積換算，比如250ml——500ul，相當(dāng)于濃縮了500倍。組織、胸腹水標(biāo)本，希望做2次過濾，第一次為標(biāo)記前，采用200目過濾，第二次為上機(jī)檢測前，采用300目過

19、濾。,2、可能的問題及解決辦法（2）、抗體環(huán)節(jié)試劑選擇A、盡量選擇試劑組合多的作為標(biāo)記抗體，比如T亞群CD45/CD4/CD3/CD8：最佳選擇CD4/CD8/CD3： 可用，但做起來會(huì)有很多麻煩單一抗體： 不可用,2、可能的問題及解決辦法B、選擇試劑時(shí)，不但需要選擇陽性標(biāo)記，同時(shí)也需要選擇陰性標(biāo)記。比如：CD4T 細(xì)胞——CD45+CD3+CD4+CD8-

20、 B 細(xì)胞——CD19+CD3- NK 細(xì)胞——CD3-CD16+56+ CD34+ 細(xì)胞——CD34+CD38-尤其在科研項(xiàng)目中，一般應(yīng)選擇2-3個(gè)陽性標(biāo)記，同時(shí)選擇1-2個(gè)陰性標(biāo)記，否則所做出來的結(jié)果將會(huì)有很大誤差。,2、可能的問題及解決辦法C、在醫(yī)學(xué)中，一般標(biāo)記抗原較弱的，需選擇較強(qiáng)的染料，尤其我們在做稀有細(xì)胞的時(shí)候，比如DC細(xì)胞，CD34細(xì)胞，CIK細(xì)

21、胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，一般均選擇標(biāo)記PE細(xì)胞。標(biāo)記條件：一般18 — 25℃，如果溫度低或高效果都不好標(biāo)記時(shí)間：根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于15 min。,2、可能的問題及解決辦法標(biāo)記的先后順序 A、先標(biāo)記膜表面的，后標(biāo)記胞漿內(nèi) B、先處理抗體，后加染料 C、透膜處理后的標(biāo)本不能強(qiáng)烈振蕩。,2、可能的問題及解決辦法 溶血環(huán)節(jié)溶血素的選擇 A、A

22、 B 液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀 C B、NH4Cl（主要成分是NH4Cl 、NH4HCO3、EDTA ） C、溶血素C（專配試劑）,,2、可能的問題及解決辦法 自配溶血素要求： A、必須在儀器試驗(yàn)后方可使用 B、有條件時(shí)需做pH、微粒分析 C、放置時(shí)間不宜過長，尤其是A液,2、可能的問題及解決辦法溶血液加入可能出現(xiàn)的問題 溶血

23、效果不好 溫度問題：C液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放 4℃冰 箱，可以采用水浴 37 ℃ 溶血?jiǎng)┎粔颍嚎梢噪x心后追加溶血?jiǎng)?以上處理如果還不可以，則需要選擇：不重要的標(biāo)本：重新再標(biāo)記重要而又沒有剩余的標(biāo)本：反復(fù)離心，選擇1200-2000轉(zhuǎn)左右的速度，建議每次離心均加入2-3mlNH4Cl溶血素。,有些抗體或染料對酸比較敏感：比如PE標(biāo)記，溶血后會(huì)使其脫離，但這種現(xiàn)象是

24、可逆的，靜置10 -30 min,2、可能的問題及解決辦法加入Flowcout環(huán)節(jié) Flowcout必須在加入溶血素后才能加入，否則會(huì)影響檢測結(jié)果，同時(shí)加入Flowcout后 2 hr 后必須上機(jī)檢測。,2、可能的問題及解決辦法（5）、檢測出結(jié)果環(huán)節(jié)：A、上機(jī)前需要搖勻標(biāo)本，儀器開機(jī)超過30min，F(xiàn)low —check 10% < 2% 外電壓穩(wěn)定等等。B、方案盡量采用完整方案，比如T亞群：由于Flowcout

25、微球在所有通道上都有信號，一般選擇沒有使用的熒光通道作為收集通道，如果沒有剩余通道，就選擇熒光較強(qiáng)的染料所在的通道方案是實(shí)現(xiàn)正確操作和得到正確結(jié)果的平臺(tái)，建議建立方 案時(shí)盡量建立完整方案,2、可能的問題及解決辦法C、檢測結(jié)果1）、檢測結(jié)果必須嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如,CD4+T細(xì)胞——CD45+CD3+CD4+CD8-(百姓定義上的結(jié)果) (醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果),2、可能的問題及解決辦法2）、相對計(jì)數(shù)：一般

26、醫(yī)院檢測T亞群時(shí)可以只做相對數(shù)，這樣就可以使用prism門，CD3+%、CD4+%、CD8+ %，如果需要濃度，則從血常規(guī)中得到 淋巴細(xì)胞的濃度 * 相應(yīng)的 % = 濃度（即所謂的 雙平臺(tái)法），這時(shí)我們可以采用縮小設(shè)行的辦法，得到準(zhǔn)確的%。3）、絕對計(jì)數(shù)：AIDS往往采用單平臺(tái)法得到濃度，這樣我們可以采用擴(kuò)大設(shè)行方法得到準(zhǔn)確的絕對數(shù)。,2、可能的問題及解決辦法3）、影響結(jié)果的因素： 電壓、補(bǔ)償不足或過頭均影響

27、 閾值設(shè)置不合理 設(shè)門范圍 Flowcout,DNA檢測,1、固定問題：70%酒精 106 細(xì)胞 700 ul 冰乙醇,,,2-3min,300 ul 蒸餾水,,4-72 hr,2、離心：1500轉(zhuǎn)3、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2）,細(xì)胞因子的檢測,1、解決干擾碎片（1）、-2

28、0℃靜置，＞24hr（2）、4500轉(zhuǎn)，離心,2、強(qiáng)度問題：外延濃度 0、5、10、20,Capture Beads,多種細(xì)胞因子FCM（STAT）的原理,Color-coded Microspheres,FL4,,Main Menu,Differentiation of 10 Populations*,,,*Human Th1/Th2 Cytokine I Kit,FL2 (Reporter Parameter),FL4(Di

29、fferentiator Parameter),,Main Menu,HLA-B27 檢測中的問題,利用B27 熒光強(qiáng)度判定的陽性率很低。 原因： 通常B27的判定標(biāo)準(zhǔn)是熒光強(qiáng)度大于8 ，但這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在加全量抗體的條件下做的，而目前大多數(shù)用戶只加半量或1/4量做，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。 解決方法： 1 加全量抗體。 2 判定標(biāo)準(zhǔn)改為用陽性率大于90%。,ANNEXIN V/P

30、I檢測凋亡的問題,結(jié)果偏低 原因：1 沒有用試劑配套的連接緩沖液。 2 消化貼壁細(xì)胞時(shí)用胰酶。 解決方法：1 消化細(xì)胞時(shí)不要用胰酶，要用EDTA，用配套的緩沖液。,結(jié)果偏高 原因：非特異性結(jié)合多 解決方法：換用新的試劑。,PNH檢測的問題,粒細(xì)胞上CD55，CD59檢測結(jié)果偏低，而在紅細(xì)胞上正常。 原因：在進(jìn)行抗體染色之前，沒有進(jìn)行溶血，導(dǎo)致了抗體先和紅細(xì)胞結(jié)合，而無法與白細(xì)胞充分