流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用?采克俊12，司維12，李亞輝123，季維智14（1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南昆明6502232.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100039；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）摘要：精液檢測(cè)的首要目標(biāo)就是快速準(zhǔn)確地確定其生育力。同時(shí)具備多種特性功能完整的精子才能受精，因而只有同時(shí)客觀地檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，才能更好地反映精子的生育力。精子檢測(cè)

2、的傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)精子數(shù)量少，指標(biāo)單一，而且易受操作者的主觀影響，不能準(zhǔn)確地反映精子功能。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)為精子功能研究提供了一種快速、客觀、多指標(biāo)、大通量的檢測(cè)手段；利用FCM檢測(cè)精子的質(zhì)膜完整性、頂體狀態(tài)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、線粒體功能以及細(xì)胞凋亡等，可以得知精子的相關(guān)功能情況。隨著新的熒光探針、染色方法的不斷開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，F(xiàn)CM為精液質(zhì)量檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)平臺(tái)，應(yīng)用前景極其廣闊。關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)；精子；檢測(cè)；熒光探針Eval

3、uationofMammalianSemenQualitybyFlowCytometryCAIKejun12SIWei12LIYAhui123JIWeizhi14(1.KunmingInstituteofZoologytheChineseAcademyofSciencesKunming650223China2.GraduateSchooltheChineseAcademyofSciencesBeijing100039China3.Col

4、legeofFoodScienceTechnologyYunnanAgriculturalUniversityKunming650201China)Abstract:Theprimarygoalofallsemenanalysesistoaccuratelydeterminethefertilizingpotentialofasemensamplerapidly.Sinceaspermatozoonmustpossessmanyattr

5、ibutesindertofertilizeanoocytetheonlywaythatwecanmepreciselypredictthefertilityistodevelopunbiasedassaysthatmeasureseveralspermtraitssimultaneously.Conventionallabatyassaysofspermatozoausingsubjectivemethodmanyaretimecon

6、sumingarenecessarilyconductedonsamplesofrelativelysmallsizefallshtofpredictingthespermfunction.Flowcytometry(FCM)permitsustoobjectivelymeasurethoussofspermfmultipleacteristicsinashttimewithminimumpreparation.Theapplicati

7、onsofFCMtoevaluationofsemenqualityincludingspermmembraneintegrityacrosomestatuschromatinstructuremitochondrialfunctionaswellasapoptosisetcprovideusvaluableinfmationregardingspermfunction.Newfluescentprobestechniquesareco

8、ntinuouslybeingdeveloped.FCMofferspowerfultools?基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（39970117）；中國(guó)科學(xué)院重大項(xiàng)目（KZ952J1109）4通訊作者（Crespondingauth）Tel:08715139413Email:記活精子的細(xì)胞核，發(fā)紅色熒光(Thomasetal1997)；CFDA和CMFDA是一種非熒光化合物，在活細(xì)胞胞內(nèi)被非特異酯酶水解，形成一種很強(qiáng)的熒光染料，發(fā)綠色熒光(

9、Penaetal1998Ericssonetal1989)。這兩類染料經(jīng)常聯(lián)合使用。對(duì)死精子特異的熒光染料雖然可以單獨(dú)使用，但效果不如聯(lián)用好。SYBR14和PI聯(lián)合使用，可以很好地檢測(cè)精子活力（Garneretal，1994；Garner&Johnson，1995）。其原理可能是PI進(jìn)入死精子頭部后端，取代了SYBR14或使SYBR14的熒光猝滅。樣品經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可得3種亞群：①被SYBR14染成綠色的活精子，并且比死精子亮得多；②

10、被PI染成紅色的死精子；③同時(shí)染上并發(fā)出兩種熒光的雙陽(yáng)性精子，正處于從活向死的過(guò)渡狀態(tài)。這種方法已用于檢測(cè)許多物種的精子活力。CFDA、CMFDA、SYTO17等分別與PI聯(lián)合染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)也可得到類似的3類精子。CarboxySNARF1也可以和PI聯(lián)合使用，CarboxySNARF1發(fā)橙紅色熒光但其熒光值大大低于PI的熒光值，用同一個(gè)探測(cè)器也能把兩者區(qū)別開(kāi)(Penaetal1999)。這一組合的優(yōu)點(diǎn)是可以和發(fā)綠色熒光的頂體

11、探針結(jié)合。否則只用PI測(cè)活力，活精子和顆粒較大的雜質(zhì)（如蛋黃顆粒）都不能被PI標(biāo)記，也就不能把兩者區(qū)分開(kāi)。Hoechst33342是一種膜通透性活體染料，死精子和活精子都標(biāo)記，而PI只標(biāo)記死精子。本研究室發(fā)展了一種僅用紫外激光就同時(shí)激發(fā)這兩種探針來(lái)檢測(cè)精子活力的方法：活精子只被Hoechst33342標(biāo)記，發(fā)藍(lán)色熒光；死精子為PI陽(yáng)性，同時(shí)也被Hoechst33342標(biāo)記，故死精子為粉紅色。這一染色方法適用于流式和熒光顯微鏡檢測(cè)，且可以

12、和發(fā)綠色或黃色熒光的其他探針合用，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)。該方法已成功地用于牛、獼猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的檢測(cè)（資料待發(fā)表）。一般認(rèn)為，在精子活力檢測(cè)的所有方法中，SYBR14與PI的聯(lián)合使用效果最佳。該組合染色時(shí)間短，對(duì)溫度要求不嚴(yán)格，且都是核染料。而其他組合染色時(shí)間長(zhǎng)，標(biāo)記的細(xì)胞器不同，易出現(xiàn)誤差。2檢測(cè)頂體狀態(tài)在受精過(guò)程中，哺乳動(dòng)物剛射出的精子在體內(nèi)要經(jīng)過(guò)獲能和頂體反應(yīng)，才能穿入卵細(xì)胞并與其融合，完成受精。因此檢測(cè)精子的頂體

13、狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。金霉素(chltetracyclineCTC)頂體染色法是熒光顯微鏡檢測(cè)的常用方法，可客觀而定量地評(píng)價(jià)精子獲能、頂體反應(yīng)(DasGuptaetal1993)。但這種染料在FCM檢測(cè)時(shí)不能很好地將獲能與未獲能的精子分開(kāi)，而且樣品要固定，所以CTC染色法不適用于FCM（Rathietal2001）。精子在獲能和頂體反應(yīng)過(guò)程中，精子膜外源凝集素受體會(huì)發(fā)生變化。因此可以利用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的凝集素檢

14、測(cè)精子的頂體狀態(tài)。已經(jīng)有多種凝集素被用于精子頂體狀態(tài)檢測(cè)，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。其中PNA和PSA較常用，PNA效果最好。經(jīng)電子顯微鏡觀察證實(shí)，PNA特異結(jié)合頂體外膜（Szaszetal2000）。FITCPNA檢測(cè)頂體反應(yīng)有兩種樣品處理方法：①樣品需要固定，F(xiàn)ITCPNA才能穿過(guò)質(zhì)膜和頂體外膜，標(biāo)記頂體。頂體完整的精子可結(jié)合更多的FITCPNA，故FITCPNA熒