流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種近年發(fā)展起來(lái)的比較先進(jìn)的技術(shù)，它利用流式細(xì)胞儀對(duì)特定細(xì)胞群體進(jìn)行分選或?qū)ι镂⒘＿M(jìn)行多參數(shù)快速定量分析［1］ 。FCM集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。FACSCalibur性能卓越，不僅通過(guò)其用戶友好的整體設(shè)計(jì)幫助臨床醫(yī)生快速實(shí)現(xiàn)常規(guī)免疫表型，CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細(xì)胞、

2、血小板等臨床分析，其更以其完美的三色分析功能成為遺傳、腫瘤、血液、免疫功能等諸多研究不可或缺的重要工具。,流式細(xì)胞儀特點(diǎn),開(kāi)灤醫(yī)院引進(jìn)的BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀,BD LSR,FACSAria,流式細(xì)胞儀的工作原理,,信號(hào)檢測(cè)--散色光,它反應(yīng)細(xì)胞FSC（小角散射)光它反應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)大小和截面積的大小SSC (90度角散射光)代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類(lèi)型的細(xì)胞群加以區(qū)分

3、,信號(hào)檢測(cè)--熒光信號(hào),,流式細(xì)胞術(shù)的操作流程,流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍,1 對(duì)細(xì)胞抗原的檢測(cè),各種血細(xì)胞都有相應(yīng)的抗原表達(dá)方式，并且不同成熟階段表達(dá)的抗原種類(lèi)也不完全相同。通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)將細(xì)胞表面抗原同標(biāo)記有特異染料的一種以上單克隆抗體結(jié)合后，在流式細(xì)胞儀同一激光光源激發(fā)下產(chǎn)生幾種特異熒光色，由熒光檢測(cè)器對(duì)每個(gè)細(xì)胞的體積、結(jié)構(gòu)、熒光種類(lèi)及性質(zhì)等多種參數(shù)同時(shí)測(cè)定，分析得到細(xì)胞群體的多種表面抗原的表達(dá)情況。FCM也可用于特異性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)

4、胞核上抗原的檢測(cè)，并協(xié)同其他實(shí)驗(yàn)指標(biāo)預(yù)示疾病的預(yù)后［2］ 。FCM也為網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)提供了快速、準(zhǔn)確的測(cè)試手段，可通過(guò)某些染料與網(wǎng)紅中RNA結(jié)合，在FCM測(cè)量時(shí)發(fā)出特定顏色的熒光，進(jìn)行單參數(shù)定量RNA。,2 對(duì)淋巴細(xì)胞及其亞群的分析,FCM進(jìn)行淋巴細(xì)胞及其亞群的分析，分類(lèi)更客觀、準(zhǔn)確。使用流式細(xì)胞儀的絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)，即加入已知數(shù)量的熒光微球，通過(guò)儀器測(cè)定時(shí)收獲的細(xì)胞數(shù)量和微球數(shù)量及血液標(biāo)本用量，直接得到每微升全血中T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)

5、（個(gè)/μl）［3］ 。用FCM檢測(cè)PBMC中p24、p24nef、p18等HIV抗原陽(yáng)性的CD4 + 細(xì)胞數(shù)可監(jiān)測(cè)體內(nèi)HIV復(fù)制情況，結(jié)果表明HIV抗原陽(yáng)性細(xì)胞與CD4 + 細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān) ［4］ 。,T淋巴細(xì)胞檢測(cè),,CD8+Ts淋巴細(xì)胞檢測(cè),B淋巴細(xì)胞檢測(cè),NK細(xì)胞檢測(cè),3 白細(xì)胞分類(lèi)分析,利用FCM的體積測(cè)定和細(xì)胞結(jié)構(gòu)測(cè)定來(lái)檢測(cè)每個(gè)白細(xì)胞的光散色強(qiáng)度，它與細(xì)胞體積、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核形狀、細(xì)胞質(zhì)性狀等多種因素有關(guān)，經(jīng)過(guò)分析可得到中

6、性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果。這種方法應(yīng)用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了臨床實(shí)驗(yàn)室的工作效率 ［5］ 。,4 病毒抗原的檢測(cè),FCM既可用于檢測(cè)受染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原，也可檢測(cè)受染細(xì)胞表面的病毒抗原。由于FCM檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞，因此FCM檢測(cè)受染細(xì)胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標(biāo)本以及經(jīng)酶消化過(guò)的組織細(xì)胞。同時(shí)由于FCM為多參數(shù)分析，因此可在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)獲得多個(gè)分析參數(shù)并能定量檢出受染細(xì)胞。當(dāng)用不同熒光

7、染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時(shí)，F(xiàn)CM可同時(shí)檢測(cè)到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原 ［6］ 。,5 病毒抗體檢測(cè),利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作為載體的病毒抗體FCM分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用。結(jié)合流式細(xì)胞儀與微球雜交法可同步檢測(cè)同一反應(yīng)管中HIV、HCV、HBV的數(shù)目和種類(lèi)，其基本原理為將檢測(cè)不同病原體的探針?lè)謩e包被微球，流式細(xì)胞儀分辨特異性結(jié)合后發(fā)出的不同強(qiáng)度的熒光。當(dāng)用FCM技術(shù)檢測(cè)HCV核

8、心抗原、NS 3 抗原抗體時(shí)，其靈敏度比酶標(biāo)免疫技術(shù)高5倍左右 ［7］,6 在器官移植中的作用,FCM通過(guò)檢測(cè)受者血清中抗供者的抗HLA的抗體，根據(jù)抗體的種型、效價(jià)、靶抗原和器官移植的類(lèi)型不同，抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)也有所不同，F(xiàn)CM比傳統(tǒng)方法更靈敏、操作時(shí)間更短并可同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞亞型、分辨出IgG和IgM抗體。巨細(xì)胞病毒（CMV）能在白細(xì)胞內(nèi)繁殖并合成CMV特異性蛋白，通過(guò)FCM檢測(cè)CMV特異性抗原及其抗原分泌量，這種技術(shù)用于CMV感染檢測(cè)

9、時(shí)感染后4h便可檢出T淋巴母細(xì)胞中CMV-DNA，從而可快速、準(zhǔn)確地反映CMV在移植受者中的早期感染狀況，對(duì)預(yù)防和減少感染具有重要意義 ［8］ 。以FCM監(jiān)測(cè)腎移植受體CD8 + 、CD38 + 、T細(xì)胞亞群的變化也可監(jiān)測(cè)CMV感染 ［9］ 。,7 檢測(cè)血小板自身抗體,FCM檢測(cè)PAIgG與ELISA相比更簡(jiǎn)便省時(shí)，檢測(cè)中操作步驟少。由于血小板被抗體-熒光素標(biāo)記而顯示陽(yáng)性，所以不受其它種類(lèi)細(xì)胞或碎片的影響，重復(fù)性好，可檢測(cè)成批或單個(gè)標(biāo)本

10、，可直觀地顯示結(jié)合PAIgG量不同的血小板群體，并可在同一份標(biāo)本上同時(shí)測(cè)定聚集和釋放功能 ［10］ 。,8 在白血病診斷中的作用,白血病是白細(xì)胞在分化到某個(gè)階段受阻后異常增殖的結(jié)果，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志可以對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型。過(guò)去對(duì)造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞分類(lèi)主要是依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)染色來(lái)進(jìn)行的，現(xiàn)在將多種檢測(cè)手段相結(jié)合，可為臨床診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后提供更多、更有力的依據(jù)。通過(guò)FCM檢測(cè)各種急性白血病細(xì)胞表面抗

11、原的表達(dá)，對(duì)臨床診斷尤為重要 ［11］ 。,9 在腫瘤診斷中的作用,通過(guò)DNA含量分析的細(xì)胞周期分布，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對(duì)治療及預(yù)后有十分重要的意義。近年來(lái)，流式細(xì)胞測(cè)量法DNA分析越來(lái)越多地應(yīng)用于實(shí)體瘤患者。DNA非整倍體的出現(xiàn)率和癌變與不典型增生程度密切相關(guān)。DNA非整倍體可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個(gè)早期指標(biāo) ［12］ 。,10 在微型生物學(xué)研究中的應(yīng)用,從現(xiàn)有的微型生物核糖體RNA序列出發(fā)，設(shè)計(jì)分類(lèi)專(zhuān)用的核酸探針，它們

12、能與核糖體RNA分子一些區(qū)域互補(bǔ)，而這些RNA分子對(duì)于目標(biāo)分類(lèi)群是唯一的，通過(guò)熒光標(biāo)記寡核苷酸鏈探針與細(xì)胞內(nèi)同源RNA序列結(jié)合，目標(biāo)種可被測(cè)出，它們的系統(tǒng)發(fā)育被確定。在這一研究中，通過(guò)原位雜交，用FCM確定雜交信號(hào)，可定量雜交信號(hào)強(qiáng)度，而細(xì)胞和特異探針雜交的平均熒光強(qiáng)度與細(xì)胞和非特異探針雜交平均熒光強(qiáng)度的比率，能計(jì)算和估測(cè)探針特異性和靈敏性。由此確定微型生物DNA含量與倍體水平 ［13］,11 用于抗生素敏感性試驗(yàn),近年來(lái)，F(xiàn)CM用于細(xì)

13、菌的藥敏效應(yīng)研究已有較大發(fā)展，F(xiàn)CM與熒光染料的聯(lián)合運(yùn)用可判斷細(xì)菌活力和功能狀態(tài)，由于速度快，該方法已被建議用作臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)藥敏試驗(yàn) ［14］。綜上所述，F(xiàn)CM具有快速、靈敏及能同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)分析的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種學(xué)科，具有廣闊的應(yīng)用前景。,目前的流式細(xì)胞儀應(yīng)用研究,1、2 345,癌癥患者外周血細(xì)胞DNA與T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞活性關(guān)系的研究,白血病的分型,肝癌患者免疫性預(yù)后的研究,中西醫(yī)結(jié)合治療胰腺炎后外周血中T細(xì)

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