流式細(xì)胞儀培訓(xùn)

1、流式細(xì)胞儀原理與應(yīng)用,陳玉嬋,提 要,流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀工作原理流式實(shí)驗(yàn)流程流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史,1930s~1950s:開(kāi)始出現(xiàn)自動(dòng)細(xì)胞分析技術(shù)（細(xì)胞的計(jì)數(shù)，是通過(guò)光電儀記錄流過(guò)一根毛細(xì)管的細(xì)胞,用結(jié)合了熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器。） 1960s晚期發(fā)展：熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì) 、細(xì)胞分選器檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào) 、單克隆抗體技術(shù) 1973年，B

2、D公司與美國(guó)斯坦福大學(xué)合作，研制開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACS I。,什么是流式細(xì)胞儀？,在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器儀器特點(diǎn)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)狹窄激光束，產(chǎn)生能夠反映細(xì)胞大小的信號(hào)，激光束激發(fā)不同的熒光素所標(biāo)記的細(xì)胞成分能發(fā)射出不同的熒光。,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象,藻類細(xì)胞,染色體,血細(xì)胞,原生動(dòng)物細(xì)胞,任何存在于懸液中的直徑為0.2-50微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析,流式細(xì)胞儀工作原理示意圖,流式

3、的基本組成：1.流動(dòng)室和 液流系統(tǒng)2.光路系統(tǒng)3.電系統(tǒng),流式細(xì)胞儀可提供的信息,物理信息：通過(guò)散射光信號(hào)反映相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度熒光信息：通過(guò)熒光強(qiáng)度反映,散射光信號(hào)的產(chǎn)生,488nm激光產(chǎn)生散射光,1. 散射光信號(hào),前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信號(hào) 反映細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC, Side

4、 Scatter） 入射激光90?角的散射光信號(hào) 反映細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性,散射光,散射光能被用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異通常使用“散點(diǎn)圖”來(lái)看散射光信號(hào)散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù),利用散射光信號(hào)對(duì)混合細(xì)胞分群,2. 熒光信號(hào),熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng),熒光信號(hào)的表示方法,雙參數(shù)點(diǎn)圖,單參數(shù)直方圖,一個(gè)完整流式實(shí)驗(yàn)的組成,樣品的處理調(diào)整儀器條件

5、數(shù)據(jù)處理,1.樣品處理,單細(xì)胞懸液的制備濃度5?105?1 ?106/mL外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、組織(經(jīng)尼龍網(wǎng)300目過(guò)濾) 制成單細(xì)胞懸液選擇合適的熒光染料染色必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少,2.儀器條件的確定,電壓閾值熒光補(bǔ)償（多色分析）,處在液流中的粒子通過(guò)激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，這些光信號(hào)通過(guò)光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（電壓）。調(diào)整

6、電壓，可使信號(hào)強(qiáng)度改變。BD流式細(xì)胞儀有兩種類型的光電探測(cè)器：光電二極管和光電倍增管（PMTs）。 PMT用于檢測(cè)較弱的SSC信號(hào)和熒光信號(hào) ，光電二極管用于檢測(cè)較強(qiáng)的FSC信號(hào),電壓,閾值,閾值：信號(hào)放大過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不需要的脈沖信號(hào)，通常來(lái)自于碎片。通過(guò)設(shè)定某一信號(hào)的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號(hào)去除，這一設(shè)定值稱為閾值。,熒光補(bǔ)償,采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差,熒光補(bǔ)償,補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,樣本準(zhǔn)備：陰性樣本

7、，單陽(yáng)性樣本調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT 第二步：?jiǎn)侮?yáng)性樣本調(diào)整補(bǔ)償判斷標(biāo)準(zhǔn)：,補(bǔ)償模型,PE-X%FITC,補(bǔ)償前,補(bǔ)償后,FITC單染,數(shù)據(jù)分析,設(shè)門設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù),設(shè)門,設(shè)門的意義：選定要分析的目標(biāo)細(xì)胞,設(shè)門,如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限,流式檢測(cè)結(jié)果的表示方法,百分率絕對(duì)計(jì)數(shù)平均熒光強(qiáng)度

8、圖形：直方圖、散點(diǎn)圖,流式細(xì)胞儀可以告訴我們什么？,流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用,細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析,細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀在微生物研究中的應(yīng)用,DNA蛋白過(guò)氧化物生成胞內(nèi)pH鑒別死/活細(xì)菌和酵母菌并計(jì)數(shù)區(qū)分革蘭氏陽(yáng)/陰性

9、細(xì)菌研究酵母菌細(xì)胞器基因表達(dá)-綠色熒光蛋白病原菌與吞噬細(xì)胞的關(guān)系-吞噬引起的呼吸爆發(fā)病毒-細(xì)胞相互作用：病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞蛋白表達(dá)的改變，對(duì)細(xì)胞周期的干擾，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響病毒引起的凋亡,流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用,HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病,補(bǔ)償調(diào)

10、整實(shí)驗(yàn),藻類細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù),細(xì)胞周期分析,DNA含量分析-PI染色,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表面，凋亡時(shí)，PS外翻向細(xì)胞外表面。重組蛋白Annexin-V可與PS結(jié)合,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞生理學(xué)研究,Ca2+流動(dòng)性檢測(cè)Ca2+ 是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)發(fā)生改變。最常用的染料Indo-1 excited

11、at UVFluo-3 excited at 488nmFura red excited at 488nm,細(xì)胞生理學(xué)研究,細(xì)胞活性分析 Fluorescein Diacetate進(jìn)入活細(xì)胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光,細(xì)胞生理學(xué)研究,細(xì)胞膜電位的改變超極化的細(xì)胞攝取更多的染料，細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度增大；細(xì)胞去極化時(shí)，染料釋放到細(xì)胞外，總的熒光強(qiáng)度減少。染料和試劑DiOC6(3)