流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)

1、流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析檢測(cè)必須基于單細(xì)胞的基礎(chǔ)上，這是流式細(xì)胞術(shù)的基本要求。因此就必須把實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液。在應(yīng)用FCM技術(shù)中，制備出合格的單分散細(xì)胞是流式細(xì)胞術(shù)樣本制備技術(shù)中重要的一環(huán)。它要求這種分散細(xì)胞方法既要使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞，又能保持細(xì)胞的固有生物化學(xué)成分及生物學(xué)特性。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備大致可分為下面五個(gè)步驟：①取材：取手術(shù)或活檢組織必須具有代表性，如取手術(shù)腫瘤組織，必須取瘤細(xì)胞

2、生長(zhǎng)旺盛部位；組織等標(biāo)本必須在取材后保持樣本的新鮮；一般在室溫1個(gè)小時(shí)之內(nèi)處理好樣本或及時(shí)用固定劑或低溫對(duì)組織進(jìn)行保存；②對(duì)細(xì)胞的待測(cè)生物化學(xué)成分進(jìn)行熒光染色；③按照廠家提供的軟件程序?qū)颖具M(jìn)行獲取、檢測(cè)和存儲(chǔ)；④再依照軟件提供的程序?qū)z測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量分析；⑤檢測(cè)分析結(jié)果在生物、醫(yī)學(xué)上的意義進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。第1節(jié)樣本單細(xì)胞懸液的制備方法樣本單細(xì)胞懸液的制備方法一新鮮實(shí)體組織樣本的制備新鮮實(shí)體組織樣本的制備FCM對(duì)單細(xì)胞快速進(jìn)行各種參數(shù)分

3、析必須基于單細(xì)胞基礎(chǔ)上，根據(jù)各種組織成分的特點(diǎn)，可選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)額高、損傷少的目的。盡管標(biāo)本制備已形成了標(biāo)準(zhǔn)化的程序，但實(shí)際操作中總會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問(wèn)題。在實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞過(guò)程中，解離的方法可能瞬間地或持久地影響細(xì)胞的性質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等。所以，在對(duì)各種不同組織進(jìn)行分散選擇方法時(shí)，應(yīng)盡量減少對(duì)細(xì)胞的這種影響。目前常用的分散組織細(xì)胞的方法有如下3種。（一）酶消化法酶消化法1作用原理：作用原理：對(duì)實(shí)體組

4、織分散的作用原理主要有3方面：①可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等；②可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì)；③可以水解組織細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì)物質(zhì)。酶消化法是實(shí)體瘤、培養(yǎng)細(xì)胞分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋白酶類——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細(xì)胞。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖

5、維。不同酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來(lái)確定使用的酶類。2注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：①酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐?，而這些溶液不致于造成酶效價(jià)降低；②要注意酶的使用濃度和消化時(shí)間；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等；④要隨時(shí)注意影響酶活性的其它因素，如酶的生產(chǎn)批號(hào)等。3方法學(xué)程序方法學(xué)程序（1）將適合于酶消化的組織置于離心管中；（2）將選好的酶溶液12ml加入盛有被消化

6、組織的試管中；（3）一般消化2030分鐘（恒溫37℃或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打；（4）終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，以低速成離心除①將組織切成薄片，置入試管中；②首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h，離心棄之；③再加入胰酶EDTA液5ml。在37℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)30min；④用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀1000prm，5min。再以生理鹽水洗23次；⑤細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆?。以上幾種分散細(xì)胞

7、的方法都是目前對(duì)實(shí)體組織解聚的常用的方法。實(shí)驗(yàn)證明，用化學(xué)試劑方法處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率低，細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集的量不穩(wěn)定；化學(xué)試劑可單獨(dú)使用，也可與其它方法結(jié)合使用；機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，單細(xì)胞產(chǎn)量低；酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散解聚較理想，但對(duì)所測(cè)化學(xué)成分有不良影響。所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣本和更好的FCM檢測(cè)結(jié)果。（四）（四）注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)①新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行處理

8、保存，以免組織在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生中心組織壞死以及細(xì)胞自溶，影響FCM測(cè)定結(jié)果；②根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇最隹的固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定；③酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時(shí)間、pH值、濃度等方面對(duì)酶消化法的影響。④需注意不同組織，選擇相應(yīng)的方法；如富于細(xì)胞的組織——淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等，就不一定采用酶學(xué)法或化學(xué)法；往往用單純的機(jī)械法就

9、可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細(xì)胞；⑤在使用酶學(xué)方法時(shí)，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤——食管癌、乳腺癌、皮膚癌等，選用膠原酶較好，因?yàn)槟z原酶具有在Ca、Mg存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特性。二組織活檢、內(nèi)窺鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸殊液的制備組織活檢、內(nèi)窺鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸殊液的制備正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)窺鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標(biāo)本，由于材料較少，制備起來(lái)比較麻煩。但其制備方法與實(shí)體組織基本相似。1取材后立即放

10、入盛少許PBS液青霉素小瓶中；2另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住并用線繩固定好，并用PBS液濕潤(rùn)；取新鮮組織標(biāo)本置尼龍網(wǎng)上；因標(biāo)本量較少，尤其是內(nèi)窺鏡取材只少要取3塊以上；3在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤(rùn)一下，然后開(kāi)始剪碎組織；4先剪幾下，視基本無(wú)組織塊存在時(shí)，用原來(lái)裝標(biāo)本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細(xì)胞均漿并過(guò)濾于小燒杯中；如果這時(shí)仍有可見(jiàn)組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該P(yáng)BS液沖洗，直至網(wǎng)上無(wú)組織塊為止。這樣可盡量多的收