流式細(xì)胞分析

1、1,流式細(xì)胞術(shù),胡嘉波江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,2,,流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer 簡稱FCM）是一項(xiàng)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。概括來說，流式細(xì)胞術(shù)就是對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術(shù)。從開始設(shè)想到第一臺(tái)儀器的問世,科技工作者進(jìn)行了不懈的努力。隨著各相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展

2、，F(xiàn)CM技術(shù)已經(jīng)成為日益完善的細(xì)胞分析和分選的工具。,3,,FCM儀器分為二大類：一類為臺(tái)式機(jī)，其特點(diǎn)為：儀器的光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡便，易學(xué)易掌握。BD公司的臨床型 FACScan也是最早可用于臨床診斷的儀器。另一類為大型機(jī)，其特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來，并且可將單個(gè)或指定個(gè)數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時(shí)可選配多種波長和類型的激光器，適用于更廣泛更靈活的科學(xué)研究應(yīng)用。,4,●流式細(xì)胞儀實(shí)

3、物,BD FACSVantage,BD-Calibur,5,,其特點(diǎn)是：①測量速度快，最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測數(shù)萬個(gè)細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測量，可以對同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。,6,,概要說來，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)

4、技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來人們在這方面的心血和成果。,7,流式細(xì)胞儀發(fā)展的歷史,起源: 1934年--- 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 雛形: 1949年--- Coulter 計(jì)數(shù)器 1959年--- B型Coulter計(jì)數(shù)器 1972年: BD(Becton-Dickinson) 第一臺(tái)流式細(xì)胞儀, 具有分選功能,8,流式細(xì)胞儀主要由三部分

5、組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下： 液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。 光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測器。 電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。,,9,在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析。在實(shí)際工作中，用實(shí)體組織進(jìn)行流式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進(jìn)行分解。被液滴包繞的

6、粒子稱為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過激光照射區(qū)時(shí)，通過激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應(yīng)的透鏡，濾片和探測器）收集。分光器和濾光片引導(dǎo)散射光和熒光至相應(yīng)的探測器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。,10,11,液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過激光束。 因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。流動(dòng)

7、室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺(tái)式機(jī)中流動(dòng)室稱為樣品槽，大型機(jī)稱之為噴嘴。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。,12,,Flow Cell,,,,,,,Injector Tip,,,,Fluorescence,signals,,Focused laser,beam,Sheath fluid,,,13,14,高流速適用于定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加

8、，可以快速獲取數(shù)據(jù)。 低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。,15,散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測,前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，檢測的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的散射光信號(hào)。FSC不受細(xì)胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。,16,Forw

9、ard Angle Light Scatter前向角,17,,側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（SSC）光與被測細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號(hào)。,18,90 Degree Light Scatter90度側(cè)向角,19,流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的信號(hào),非熒光信號(hào),顆粒度,,,細(xì)胞大小,20,,上述兩種信號(hào)都是來自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細(xì)胞亞群

10、，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開。,21,,22,熒光信號(hào),熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱為熒光。 能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質(zhì)的發(fā)

11、射波長范圍叫做發(fā)射光譜。,23,,目前的流式細(xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示， 488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)，而當(dāng)FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長激發(fā)時(shí)，也會(huì)檢測到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。,24,,,25,,,26,27,Phycoeryt

12、hrin (PE),,,,,,,,,,,,,,,,,,,400 nm,600 nm,700 nm,,,,,Wavelength,,,,Excitation,Emission,,,500 nm,Fluorescent Dyes,28,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ethidium,PE,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cis-Parinaric acid,Tex

13、as Red,PE-TR Conj.,PI,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,FITC,,,,,,Common Laser Lines,29,,,30,,對單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過分析細(xì)胞表面抗原標(biāo)記確認(rèn)細(xì)胞類型。在細(xì)胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。

14、每個(gè)亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞種類，并可以得到各細(xì)胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。,31,32,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,,,,,,,,,,,,,,,,,,Bandpass,Filters,Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry,,La

15、ser,,1,2,3,4,Flow cell,,,,,,,,,,,33,,臺(tái)式機(jī)通常配有兩根激光器：第一根激光器波長為488nm。第二根為波長635nm的紅二極管固態(tài)激光器。,34,數(shù)據(jù)分析,,35,,,Immunophenotyping,,,CD2,,CD4,36,設(shè)門 通過設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴

16、細(xì)胞亞群的熒光特性。,37,,,38,,直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。,39,,,40,,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞619個(gè)，M2（CD3陽性）細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。,41,,二維點(diǎn)圖以雙參

17、數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖為陰性對照圖，用于設(shè)定陰性對照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽性細(xì)胞以及雙陽性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細(xì)胞（CD19 PE），右下象限（LR）為X軸陽性細(xì)胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。,42,,如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43

18、%。,43,分 選,,44,,,,,,488 nm laser,,-,,,,,,,,,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,,,FALS Sensor,Fluorescence detector,,,,,,,,,,,Purdue University Cytometry Laboratories,45,流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用,46,1.檢測淋巴細(xì)胞亞群，監(jiān)測細(xì)胞免疫狀態(tài)2.

19、白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系4.干祖細(xì)胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多態(tài)性檢測; 腫瘤癌基因及 抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細(xì)胞內(nèi)酶;耐藥蛋 白的分析等等。,臨床常見應(yīng)用,47,HLA-B27檢測 外周血HLAB27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生有很大程度的相關(guān)性.循環(huán)血中活化血小板（CD62P、CD63）：

20、 糖尿病伴微血管病變、冠心病、高血壓病、高脂血癥、腦血栓形成、短暫性腦缺血發(fā)作、腦動(dòng)脈硬化患者活化血小板百分率和絕對值顯著高于正常人。而糖尿病無微血管病變、周圍血管病變以及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無顯著差異。PTCA后24小時(shí)發(fā)展成急性血管閉塞或高度再狹窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于預(yù)測PTCA后急性缺血再發(fā)作的危險(xiǎn)性。,48,微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞,靈敏度:10-7,49,細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，

21、G1，S，G2 ，M)的各個(gè)時(shí)期，DNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.,DNA含量及細(xì)胞周期分析,50,,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,0,

22、200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,51,0,200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2N,4N,Counts,G0/G1,G2/M,S,,,,,PI 熒光強(qiáng)度(DNA含量),流式DNA周期示意圖,52,定量分析,1.檢測細(xì)胞特異

23、性標(biāo)記物：FCM不但可以定性分析標(biāo)記物，而且可以進(jìn)行定量。用標(biāo)記已知數(shù)量的熒光素分子的標(biāo)準(zhǔn)微球作參照，可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞抗原定簇的個(gè)數(shù)。 2.CD4絕對計(jì)數(shù) 3.CD34絕對計(jì)數(shù) 4.血小板絕對計(jì)數(shù) 5.可溶性物質(zhì)(如細(xì)胞因子)的高通量定量檢測,53,血小板計(jì)數(shù)新標(biāo)準(zhǔn)(雙平臺(tái)法),,,,,R = 紅細(xì)胞數(shù)R3/血小板數(shù)R1(流式),血小板數(shù)=紅細(xì)胞數(shù)(血球儀)/R,(國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)/國際實(shí)驗(yàn)血液學(xué)協(xié)會(huì)(ISL