流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于銅綠假單胞菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)的研究.pdf

1、目的：傳統(tǒng)的抗生素敏感試驗(yàn)包括：稀釋法(肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法)、紙片擴(kuò)散法和E．試驗(yàn)，均需要將細(xì)菌在藥物作用下培養(yǎng)過夜才能觀察結(jié)果，相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前多采用比濁法目測(cè)結(jié)果，提供的結(jié)果代表細(xì)菌生長(zhǎng)的均數(shù)，對(duì)亞菌群的敏感性無法判斷。流式細(xì)胞儀可同時(shí)、快速、多參數(shù)地分析單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性，已經(jīng)被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域。銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosaPA)是醫(yī)院感染的三大病原茵之一，探索一種快速檢測(cè)此類細(xì)菌及其藥

2、物敏感性的方法，對(duì)于重癥感染性疾病的快速診斷和治療，預(yù)防和治療醫(yī)院感染，減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播，減少患者和醫(yī)院的負(fù)擔(dān)有重要的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。 本試驗(yàn)選擇能夠通過破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并與核酸相結(jié)合的熒光染料碘化丙啶(PI)，使其著染于經(jīng)過抗生素處理后的細(xì)菌，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌熒光信息的變化，推斷細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性和藥物的最低抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)。并與傳統(tǒng)的試

3、管稀釋法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，客觀判斷流式細(xì)胞熒光術(shù)抗生素敏感試驗(yàn)(Flowcytofluorometricantibioticsusceptibilitytest，F(xiàn)CST)的優(yōu)缺點(diǎn)，為該方法在臨床上的應(yīng)用積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：我們收集了2003-2004年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院外科及重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染患兒的臨床標(biāo)本中分離出的銅綠假單胞菌共22株，并購(gòu)買了質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853。將細(xì)菌轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板，35℃孵育過夜，次日

4、從平板上挑取1～2個(gè)菌落，接種于M-H肉湯培養(yǎng)基中，于35℃恒溫水浴箱中培養(yǎng)2小時(shí)，用VITEK比濁儀調(diào)整菌液濃度至0．5麥?zhǔn)蠁挝?相當(dāng)于1．5×10ScFU／m1)。在測(cè)定管中加入亞胺培南1．Oral使其終濃度為32．0、16．0、8．O……0．25、O．125ug／ml，然后在測(cè)定管中加入細(xì)菌懸液1．Oral，調(diào)整使其終濃度為7．5×106CFU／ml，37．0~C孵育3小時(shí)后加入染料PIlOul(最終濃度為10ug／m)室溫避光5

5、分鐘后，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)104以上個(gè)細(xì)菌。根據(jù)熒光信息的變化判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。隨著藥物濃度的增加，如果碘化丙啶熒光陽(yáng)性百分率(PI％)或平均熒光強(qiáng)度(MFI)均在狹窄范圍內(nèi)，無明顯上升，判斷為菌株耐藥；若PI％逐漸增至75％或以上，則此時(shí)的最低藥物濃度為MIC，表示細(xì)菌對(duì)藥物敏感；或MFI突然增加50％或以上，則推斷此時(shí)的最低藥物濃度為MIC，且細(xì)菌敏感。 結(jié)果：根據(jù)NCCLS(Nationalcommitteeforcl

6、inicalLaboratoryStandard)規(guī)定，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：MIC~<4ug／ml為敏感，MIC≥16ug／ml為耐藥。據(jù)此，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853與22株臨床分離菌株FCST檢測(cè)結(jié)果和試管稀釋法檢測(cè)結(jié)果完全一致。 對(duì)于編號(hào)為19和22的二株銅綠假單胞菌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加PI％雖然有上升，但各個(gè)PI％值均在50％以下，同時(shí)MFI亦無明顯增加，增加幅度不超過40％。我

7、們判斷19號(hào)和22號(hào)菌株對(duì)亞胺培南耐藥。對(duì)于其余20株細(xì)菌，隨著藥物濃度的增加PI％均逐漸增加至75％或以上，或MFI增加幅度超過50％。我們將PI％逐漸增加至75％或以上，或者M(jìn)FI增幅超過50％或以上的最低藥物濃度判定為亞胺培南的MIC，且菌株對(duì)藥物敏感。 將試管稀釋法和FCST檢測(cè)的MIC相比較，以PI>~75％或以上為判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，22株臨床分離菌株中有17株細(xì)菌的MIC完全一致(77．3％)，4株細(xì)菌MIC相差1個(gè)稀釋度

8、(18．2％)，l株細(xì)菌MIC相差2個(gè)稀釋度(4．5％)，相差1個(gè)稀釋度時(shí)二者的一致性為95．4％，相差2個(gè)稀釋度時(shí)一致性為100％。以MFI增加50％或以上為判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，有16株檢測(cè)的結(jié)果相同(72．7％)，有5株檢測(cè)結(jié)果相差1個(gè)稀釋度(22．7％)，有1株檢測(cè)結(jié)果相差2個(gè)稀釋度(4．6％)。相差1個(gè)稀釋度時(shí)二種方法一致性為95．4％，相差2個(gè)稀釋度時(shí)一致性為100％。證明我們的研究方法是可行的。 結(jié)論：1)本研究成功建立了銅