應(yīng)用基因芯片集成系統(tǒng)快速診斷8種豬病病原.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以嚴(yán)重影響豬生長(zhǎng)、健康、繁殖的8種重要的病原為研究對(duì)象，構(gòu)建了能同時(shí)、快速、診斷這8種病原的cDNA芯片檢測(cè)技術(shù)的平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)研究的相關(guān)病原有豬日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、口蹄疫病毒O型和AISAⅠ型（Foot-and-Mouth Disease O and AISAⅠ，F(xiàn)MDV-O and FMDV-

2、 AISAⅠ).、豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬細(xì)小病毒 (Porcine parvovirus，PPV)、豬圓環(huán)病毒-Ⅱ型(Porcine circoviruses-Ⅱ，PCV-2)和豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）。
　　 基因芯片技術(shù)是90年代伴隨著人類基因組計(jì)劃

3、的實(shí)施而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，它采用了并行處理和高度集成技術(shù)，是一種快速、高效、并行、高通量的基因水平的診斷技術(shù)，可以應(yīng)用于并行檢測(cè)數(shù)百個(gè)疾病相關(guān)分子。生物芯片技術(shù)在科學(xué)研究上的廣泛應(yīng)用，并逐步發(fā)展成為實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，有很多優(yōu)點(diǎn)，如大規(guī)模、高通量、快速檢測(cè)等。
　　 本研究希望構(gòu)建一種在基因水平提供處理一次樣品就可以鑒別診斷這8種病原的基因芯片診斷方法。研究的內(nèi)容主要包括：選取JEV、PRV、

4、PRRSV、PPV、PCV-2、CSFV、FMDV-O、FMDV-AISAⅠ病原核酸的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)8對(duì)特異性引物，對(duì)經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的8種病原提取的核酸作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將8種病原擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMDT-18載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并濃縮純化作為探針，以0.6μg/μL的濃度點(diǎn)制于經(jīng)過(guò)氨基修飾的玻片上；另以經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的8種病原提取的核酸作為模板，進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物制備成靶物，并與陽(yáng)性質(zhì)控按照10：3

5、的比例純化后標(biāo)記CY3，分別與cDNA芯片探針置55℃雜交爐過(guò)夜雜交，雜交后洗滌，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Genepix4000A掃描儀讀取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用8對(duì)特異性引物對(duì)這8種病原核酸進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的產(chǎn)物作為靶物均可以特異地與制備好的cDNA芯片探針結(jié)合，綠色熒光信號(hào)清晰可見(jiàn)，背景值均一，即試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的8種病原芯片探針可以特異地檢測(cè)這8種病原；檢測(cè)敏感性比普通PCR高；批內(nèi)、批間試驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用cDNA芯片檢測(cè)這8種病原具有較好的穩(wěn)定性。實(shí)