用于診斷四種豬疫病病毒寡核苷酸芯片的研制.pdf

1、高發(fā)性呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)主要病毒性病原的混合感染和持續(xù)感染，使得集約化養(yǎng)豬業(yè)疫病流行狀況呈現(xiàn)高度復(fù)雜化、多樣化趨勢，進而增加了臨床和實驗室診斷難度。目前，對豬疫病病毒性病原的診斷仍采用傳統(tǒng)的病原分離和免疫血清學(xué)方法，其操作費時費力且靈敏度不高。分子生物學(xué)診斷方法如：PCR、標記探針雜交等技術(shù)的應(yīng)用，雖然具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便的特點，但其假陽性率較高且一次僅能檢測一種或同時檢測兩三種病毒。基于上述技術(shù)的缺點，本

2、研究應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)，結(jié)合不對稱PCR和間接熒光標記技術(shù)，制備一款低密度豬疫病病原診斷基因芯片，以滿足目前集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中流行性病疫原快速、準確、高通量的檢疫要求。 本研究確定集約化養(yǎng)豬業(yè)常見的4種豬疫病病毒：豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬藍耳病毒作為檢測對象。根據(jù)四種不同病毒的保守區(qū)域設(shè)計擴增短片斷(100-300 bp)PCR產(chǎn)物的特異性引物。依據(jù)每種短片斷PCR產(chǎn)物序列，篩選出四條高度特異、長度相同、Tm值和

3、G+C％含量接近的檢測探針，并將其固定在氨基化修飾的片基上，制備成低密度60-mer寡核苷酸診斷芯片。通過標記樣本與檢測探針在固液相體系中雜交，一次試驗可完成對這四種豬疫病病毒的診斷。在實驗過程中，對芯片上探針點樣濃度的選擇，每種病毒選擇正義鏈或是反義鏈探針作為檢測探針以及雜交條件等實驗過程進行探索和優(yōu)化。以上述四種豬疫病病毒為檢測模型，對經(jīng)過優(yōu)化的豬疫病病毒診斷基因芯片集成系統(tǒng)的靈敏度和特異性進行評估和鑒定。 通過一系列試驗，

4、本研究取得如下的成果：(1)制作出背景低、固定效率高的豬重要病毒性疫病原多重檢測的基因芯片；(2)通過優(yōu)化實驗，確定了芯片上探針點樣濃度的最佳濃度為25μM； (3)不對稱PCR體系中通過變換上下游引物作為限制性引物，雜交后結(jié)果進行比較，最終確定豬流感病毒、豬偽狂犬病毒及口蹄疫病毒以反義鏈探針作為檢測探針，而豬藍耳病毒則以正義鏈探針作為檢測探針； (4)通過用間接熒光標記技術(shù)引入熒光基團，在雜交溫度為60℃，雜交時間為10h的條件下，能