轉(zhuǎn)基因食品DNA提取及寡核苷酸芯片檢測技術(shù)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)是利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費品質(zhì)等方面向人們所需要的目標轉(zhuǎn)變。以轉(zhuǎn)基因生物為直接食品或為原料加工生產(chǎn)的食品就是“轉(zhuǎn)基因食品(Genetically Modified Foods，GMF)”。
　　 隨著基因工程技術(shù)的日趨成熟及在農(nóng)產(chǎn)品上的廣泛應用，轉(zhuǎn)基因食品應運而生，并以驚人

2、的速度進入人們的生活。2011年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達1.6億公頃，比1996年的170萬公頃增長94倍，而以轉(zhuǎn)基因作物為原材料加工的食品已達上萬種。轉(zhuǎn)基因食品給人類帶來了豐富的食品供應和巨大的經(jīng)濟效益，但到目前為止，轉(zhuǎn)基因食品對人類健康的安全性一直受人們質(zhì)疑。某些轉(zhuǎn)基因食品引起中毒、過敏反應、降低人體抵御病毒的能力、改變機體腸道菌群平衡等危害已有報道。為了維護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，世界上的很多國家和地區(qū)先后出臺了相應的法律和管理方

3、法，對轉(zhuǎn)基因食品實行強制標識或自愿標識。2002年我國農(nóng)業(yè)部頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，規(guī)定對5大類17種產(chǎn)品必須進行標識。
　　 對轉(zhuǎn)基因食品進行標識基于能檢測到轉(zhuǎn)基因成分。因此建立準確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)至關(guān)重要，而高質(zhì)量DNA模板的獲取，是轉(zhuǎn)基因食品進行基因檢測的前提和關(guān)鍵。
　　 核酸提取包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其

4、它成分，如蛋白質(zhì)、多糖、鹽等雜質(zhì)徹底分離去除的過程。裂解方法包括化學裂解法（表面活性劑SDS、CTAB、高鹽等）、酶裂解法（蛋白酶K、溶菌酶、裂解酶等）和機械裂解法（研磨等）。最常用的純化方法，一是有機溶劑抽提再沉淀，二是介質(zhì)純化。介質(zhì)純化是利用某些固相介質(zhì)，在特定的條件下選擇性吸附的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)的分離。
　　 由于加工食品成分復雜，DNA破壞降解嚴重，因此從加工食品中提取DNA，潛在困難很大。目前國內(nèi)外很多

5、學者在積極探索、深入研究各種高效的轉(zhuǎn)基因食品DNA提取方法。本研究針對轉(zhuǎn)基因食品的不同加工程度，構(gòu)建和優(yōu)化了各種加工程度的食品DNA的提取方法。
　　 首先，對于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品，采用Chelex-100法快速提取轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA，Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯共聚體組成的化學離子螯合樹脂，其懸液在堿性環(huán)境(pH10～11)和100℃的條件下，可導致細胞破裂，DNA從細胞核中釋放，同時Chelex-100能結(jié)合許多可

6、能影響下一步分析的非核酸物質(zhì)。由于Chelex-100能有效除去非核酸有機物，并且通過結(jié)合金屬離子，防止DNA降解，具有經(jīng)濟、簡便、高效等優(yōu)點，目前已被廣泛用于從微量血液、組織斑塊、精斑、骨骼等法醫(yī)物證檢材。本研究比較國標（GB/T19495.3-2004）CTAB-1法和Chelex-100法提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 DNA濃度和純度，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示Chelex-100法提取的DNA濃度較國標CTAB-1法

7、高(t濃度=10.424，P濃度=0.000)，而純度較CTAB-1法低（t純度=12.684，P純度=0.000），但是作為模板用于PCR擴增，效果與CTAB-1提取方法并無明顯差別;對比兩種方法提取的DNA在-20℃下保存一個月內(nèi)的PCR檢測效果，結(jié)果未見明顯差別;將Chelex-100法應用于其他農(nóng)產(chǎn)品的DNA提取，效果理想。
　　 其次，對于輕中度加工食品，采用改良傳統(tǒng)的CTAB法。CTAB法是提取植物DNA的經(jīng)典方法，

8、也是文獻報道最多的提取轉(zhuǎn)基因食品DNA的方法，但是傳統(tǒng)的CTAB法由于操作繁瑣，耗時長，試劑組成復雜，酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染等問題，在使用上受到一定的限制。本研究改良傳統(tǒng)CTAB法，利用硅膜吸附柱純化DNA，減少應用氯仿等有毒的有機溶劑，大大縮短了操作時間，比較該方法與國標(GB/T19495.3-2004) CTAB-1法提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 DNA的濃度和純度，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示改良CTAB法提

9、取的DNA濃度和純度均較國標CTAB-1法高(t濃度=9.471，P濃度=0.001;t純度=3.253，P純度=0.031)，差異具有顯著性意義，表明該方法提取的DNA效果較理想，同時將其應用于輕中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果。
　　 第三，針對油脂經(jīng)過深加工，DNA含量低，且受破壞嚴重，提取難度大的特點，本研究利用硅膜吸附柱為介質(zhì)，結(jié)合DNA擔體鮭魚精子DNA，建立了一種穩(wěn)定有效的從食用油中提取DNA的方法，將其應

10、用于5個品牌11種食用油的DNA提取，核酸進行定性PCR、LAMP、熒光定量PCR檢測，效果理想。
　　 最后，高質(zhì)量DNA模板的提取是轉(zhuǎn)基因食品檢測的前提與關(guān)鍵，而轉(zhuǎn)基因成分的檢測是最終目標。目前轉(zhuǎn)基因食品檢測包括基于外源蛋白質(zhì)靶標的蛋白質(zhì)檢測方法和基于核酸水平的檢測方法。由于蛋白質(zhì)檢測成本高，所需時間長，加上蛋白質(zhì)對熱敏感，加熱過程中容易變性，經(jīng)過加工的轉(zhuǎn)基因食品，絕大部分蛋白質(zhì)變性，檢出率較低，現(xiàn)在該類檢測實際工作中較少涉

11、及。核酸水平的檢測包括PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)檢測等。單純的PCR檢測技術(shù)有容易污染、易出現(xiàn)假陽性等缺點?；蛐酒夹g(shù)是近年來在生命科學領(lǐng)域興起的一項生物高新技術(shù)，具有快速、敏感、準確、高通量等特點，可對大樣本的樣品進行篩查及鑒定。靶基因的標記是基因芯片實驗流程的一個重要環(huán)節(jié)，多重PCR擴增標記是在多重PCR擴增過程中加入熒光標記，在擴增的同時進行熒光標記，特異性高。多重PCR與基因芯片整合可以實現(xiàn)兩種技術(shù)的優(yōu)勢互補，通過PCR的擴增標

12、記作用和芯片的熒光探針雜交技術(shù)可使此種檢測體系達到較高的靈敏度和特異度。本研究針對轉(zhuǎn)基因食品5大物種13個品系的篩選基因、目的基因、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)化體特異性基因設(shè)計特異性引物和探針，建立了5大物種13個品系的轉(zhuǎn)基因食品基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片方法檢測方法，對各個品系轉(zhuǎn)基因食品標準品進行檢測，達到較理想檢測效果。
　　 本課題通過實驗室研究，得到以下實驗結(jié)果:
　　 1、探究了一種經(jīng)濟、簡便、快速的DNA提取方法——

13、Chelex-100法，適合于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的大規(guī)模篩選和鑒別;
　　 2、改良傳統(tǒng)CTAB法，利用硅膜吸附柱純化DNA，減少應用有毒的有機溶劑，大大縮短了操作時間，將其應用于輕中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果;
　　 3、構(gòu)建了一種效果佳、通用性好、性價比高的油脂DNA提取方法，穩(wěn)定有效地從食用油中提取DNA;
　　 4、在芯片的探針設(shè)計、樣品擴增標記和雜交過程中，引入多種探針及樣品作為內(nèi)、外質(zhì)量控制，有

14、效的防止了檢測應用中假陽性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生;
　　 5、采用多重PCR法進行基因組擴增標記，完成了芯片的實驗室測試，實驗結(jié)果表明多重PCR擴增標記技術(shù)是一項良好的DNA標記技術(shù);
　　 6、針對5大物種13個品系轉(zhuǎn)基因作物設(shè)計了26條寡核苷酸探針，制備轉(zhuǎn)基因食品檢測基因芯片，對各個品系標準品進行檢測，結(jié)果與標準品符合率達100％，表明該芯片能初步應用于轉(zhuǎn)基因樣品的篩查與檢測。
　　 綜上所述，轉(zhuǎn)基因食品DNA的

15、提取和純化是轉(zhuǎn)基因食品檢測的基礎(chǔ)與前提，建立一套系統(tǒng)、完善的轉(zhuǎn)基因食品的DNA提取方法至關(guān)重要。根據(jù)不同加工程度的轉(zhuǎn)基因食品建立的轉(zhuǎn)基因食品DNA提取方法具有針對性好、效率高、效果穩(wěn)定等優(yōu)點，所提取的DNA能滿足定性PCR、實時熒光定量PCR、LAMP和基因芯片檢測等分子生物學的實驗需求?；诙嘀豍CR的轉(zhuǎn)基因食品寡核苷酸基因芯片檢測方法，綜合利用了多重PCR的高效率擴增標記和基因芯片具有大規(guī)模、高通量、高度敏感與高度特異性等特點，可以