利用寡核苷酸芯片對Roundup Ready轉基因大豆檢測及鑒定技術的研究.pdf

1、面對愈來愈復雜的正在研究和即將上市的轉基因植物,傳統(tǒng)的目前應用最廣泛的PCR檢測技術已不能完全滿足大量、快速和對未知轉基因產品檢測的要求.基因芯片技術的出現(xiàn),實現(xiàn)了對樣品的高通量檢測與篩選,檢測效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍.但目前基因芯片技術(寡核苷酸微陣列)應用于轉基因檢測的研究不僅僅處于初期階段.該研究選取其遺傳背景信息清楚,商業(yè)化應用非常廣泛的轉基因模式植物-Roundup Ready轉基因大豆作為主要研究材料,Bt176和Bt

2、11轉基因玉米為輔助研究材料,將寡核苷酸芯片檢測技術應用于Roundup Ready轉基因大豆檢測及鑒定的研究,對以下幾方面的問題進行了研究和探討.一、針對Roundup Ready轉基因大豆的基因盒結構及其它對照轉基因材料就篩選基因,種屬相關基因,目的基因,交聯(lián)結構基因,特異結構基因等15個基因進行了普通PCR擴增并測序鑒定.每個基因的擴增都以轉基因和非轉基因模板DNA對照進行.結果表明,按CTAB法提取的DNA符合PCR擴增要求,轉

3、基因和非轉基因模板DNA對每個目的基因的擴增都與預期結果一致,說明PCR反應體系正常,模板DNA未被污染.對每個目的片段的直接測序結果與設計的引物擴增片段序列相符.二、制備檢測及鑒定Roundup Ready轉基因大豆的寡核苷酸芯片;測序結果包含探針序列或互補序列,所產生的有效信號與預期結果一致,與凝膠電泳檢測結果相符,表明所制備的寡核苷酸芯片特異性好;寡核苷酸芯片檢測靈敏度及特異性要優(yōu)于凝膠電泳法檢測.三、對芯片檢測中常用的兩種熒光標

4、記法-隨機引物熒光標記法和PCR反應熒光標記進行了比較研究.從檢測特異性,信號強度,信噪比指標進行綜合評價,對轉基因檢測的寡核苷酸芯片配合PCR反應熒光標記法為佳.四、針對Roundup Ready轉基因大豆建立及優(yōu)化了兩套多重PCR反應體系(分別為四重及五重PCR反應),兩套多重PCR產物混合雜交,可在一張芯片上同時檢測8個相關基因,從而實現(xiàn)利用該寡核苷酸芯片完成對Roundup Ready轉基因大豆檢測及鑒定的目的.五、對Bt176

5、和Bt11轉基因玉米和非轉基因玉米建立及優(yōu)化了五重PCR反應體系;現(xiàn)有寡核苷酸芯片可有效檢測及鑒定Bt176和Bt11轉基因玉米,確證該寡核苷酸芯片的特異性能良好.六、針對影響多重PCR產物雜交信號的有關因素進行優(yōu)化,并與通常使用的雜交體系進行比較,結果表明,雜交時間宜為40分鐘,SSC濃度宜采用5×SSC外,雜交溫度,甲酰胺濃度與通常雜交條件無異,強調熒光標記好的PCR產物雜交前要進行變性處理.該課題的開發(fā)和研究結果為寡核苷酸芯片技術