寡核苷酸芯片技術(shù)在艾滋病病毒基因檢測中的應(yīng)用.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，即艾滋病。從1981年發(fā)現(xiàn)首例艾滋病到現(xiàn)在歷時不過二十年，與人類的歷史相比只是短暫的一瞬，但是與天花、流感等瘟疫相比，艾滋病對人類的健康、經(jīng)濟、社會和文化造成的影響，更為嚴重、明顯并日益加重。早期、快速、準確的診斷，對于AIDS的預(yù)防和治療至關(guān)重要。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)有近95％的艾滋病感染者未被檢出，而血液篩查是一良好的排查及預(yù)防途徑。現(xiàn)有的血液篩查HIV方法主要包括

2、ELISA法和NAT法，存在難以早期診斷、低通量、假陽性、假陰性率高等問題。本課題采用基因芯片技術(shù)，探索對HIV病毒感染進行早期、敏感、準確和快速的檢測并分型。 基因芯片技術(shù)是一項集物理學(xué)、微電子技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)等眾多學(xué)科為一體的交叉融合的高新科技，其快速、高效、經(jīng)濟、便于系統(tǒng)集成和大規(guī)模信息的適時處理等顯著優(yōu)點為艾滋病從基因水平檢測HIV提供了一個良好的平臺。特別是近期出現(xiàn)的預(yù)合成后直接點樣制備的長鏈寡核苷酸芯片

3、，因其成本低、特異性好，逐步為實驗室和市場所采用。本研究同時采用一種通用于DNA和RNA的全基因組標記技術(shù)，結(jié)合基因芯片技術(shù)，初步應(yīng)用于HIV的早期臨床診斷及分型。 本課題通過實驗室研究，得到以下實驗結(jié)果： 1.選取四種經(jīng)不同表面處理物質(zhì)包被的芯片片基及四種不同點樣液制備0ligo芯片，本實驗驗證結(jié)果表明，點樣液3×SSC與丙烯酰胺聚合物表面(國產(chǎn)玻片)聯(lián)合使用對于60mer左右的長鏈寡核苷酸芯片反應(yīng)效果最佳。該研究為芯

4、片的下游技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。 2.在芯片的探針設(shè)計、樣品擴增標記和雜交過程中，引入多種探針及樣品作為內(nèi)、外質(zhì)量控制，有效的防止了臨床試驗中假陽性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。 3.設(shè)計了66條60mer長寡核苷酸探針，并將其點樣制備HIV檢測及分型寡核苷酸基因芯片。采用限制性熒光標記技術(shù)和隨機PCR標記技術(shù)分別對DNA和RNA樣品進行了全基因組擴增標記，完成了芯片的實驗室測試。實驗結(jié)果表明隨機PCR標記技術(shù)是一項用于RNA樣品標記的良

5、好技術(shù)，同時檢測分析樣品的DNA和RNA，為臨床治療提供相關(guān)依據(jù)。 4.對11例臨床初篩HIV抗體陽性患者血清診斷的結(jié)果為陽性8例，與巢式PCR符合率為100％。同時對陽性樣品中的3例進行直接測序，B亞型2例，C亞型1例，基因芯片檢測分型結(jié)果與之基本相符。表明該芯片能初步用于臨床樣品的檢測與分型。 5.穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，本實驗室制備的芯片保質(zhì)期至少為三個月，流水線作業(yè)的芯片生產(chǎn)中，密封性是其一個重要的指標。 綜