對(duì)蝦病原檢測(cè)基因芯片的設(shè)計(jì)與初步研制.pdf

1、隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，其病害也日益嚴(yán)重，對(duì)蝦病害種類(lèi)越來(lái)越多。病毒、細(xì)菌、立克次氏體、真菌等多種病原都能感染對(duì)蝦，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已發(fā)現(xiàn)50多種能感染對(duì)蝦的病原，引起養(yǎng)殖對(duì)蝦發(fā)病死亡，并且往往不是單一病原感染，病毒感染不僅常伴有細(xì)菌，而且可能是多種病毒同時(shí)感染。為此建立高通量、高速度、高靈敏度的對(duì)蝦病原微生物檢測(cè)技術(shù)顯得格外重要。本文分析篩選了對(duì)蝦病原核酸序列后，設(shè)計(jì)和初步研制了能同時(shí)檢測(cè)多種對(duì)蝦病原的基因芯片技術(shù)。 根據(jù)

2、Lightner藍(lán)皮書(shū)和我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病害，選擇對(duì)蝦的9種病毒、6種細(xì)菌、1種真菌和1種立克次氏體為研究對(duì)象，在NCIBI中分別檢索他們的核酸序列，進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，Omiga軟件Alignment多重比對(duì)，找出各種病原核酸序列的保守區(qū)和特異區(qū)序列，將篩選確定的各條序列，同時(shí)導(dǎo)入到微陣列(microarray)專(zhuān)門(mén)的引物和探針設(shè)計(jì)軟件.AlleleID 3.0，根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，在同一個(gè)任務(wù)下批量設(shè)計(jì)出退火溫度等各項(xiàng)參數(shù)

3、十分相似，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200-500bp的引物。再根據(jù)擴(kuò)增片段序列，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為57bp的寡核苷酸探針。將設(shè)計(jì)好的引物和探針再通過(guò)BLAST搜索篩選確定其特異性后，由生物公司合成。本研究針對(duì)選擇的研究對(duì)象，共設(shè)計(jì)了43對(duì)引物和43條相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針。其中包括以宿主對(duì)蝦序列為模板設(shè)計(jì)的引物和探針，用來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。 本文先針對(duì)部分引物進(jìn)行了特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所采用的9對(duì)特異性引物，分別以含有WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、創(chuàng)傷

4、弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌DNA為模板，均能特異性的PCR擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的產(chǎn)物，同時(shí)驗(yàn)證了用來(lái)作為檢測(cè)DNA病原的陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)建立一步法RT-PCR方法，也驗(yàn)證了為檢測(cè)RNA病毒的陽(yáng)性對(duì)照。之后，采用同步。PCR方法和一步法RT-PCR方法對(duì)各個(gè)目標(biāo)序列進(jìn)行地高辛標(biāo)記，并測(cè)定標(biāo)記濃度為80ng/μl-100ng/μl。 將合成后的探針按照設(shè)定的位置分布用手動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)在帶正電的尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上組成寡核苷酸

5、膜芯片。將DIG標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與膜芯片雜交實(shí)驗(yàn)中，首先驗(yàn)證了芯片上的寡核苷酸探針的雜交的特異性，無(wú)交叉雜交反應(yīng)。之后設(shè)計(jì)了芯片上寡核苷酸探針的濃度梯度，與芯片雜交的DIG標(biāo)記產(chǎn)物濃度梯度以及雜交時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行芯片雜交靈敏度的摸索和雜交條件優(yōu)化。結(jié)果顯示：芯片上的寡核苷酸濃度為20μmol/L即能與DIG標(biāo)記產(chǎn)物發(fā)生明顯的陽(yáng)性顯色反應(yīng)；芯片能檢測(cè)到16ng/μl濃度的DIG標(biāo)記產(chǎn)物，推算芯片的能檢測(cè)到60pg對(duì)蝦病原DNA和80pg的