念珠菌血癥臨床分析及病原基因芯片檢測(cè)方法的研究.pdf

1、念珠菌血癥是由念珠菌所致的血流感染。近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用、免疫抑制人群的增加及有創(chuàng)診斷和治療措施的廣泛開展，其發(fā)病率日益增高，念珠菌已位居醫(yī)院內(nèi)所有血流感染病原菌的第4位。念珠菌血癥主要由白念珠菌引起，然而近年來(lái)非白念珠菌比例逐漸升高，且近來(lái)發(fā)現(xiàn)部分非白念珠菌感染的致病菌具有對(duì)常規(guī)抗真菌藥物的天然耐受性，給臨床治療增加了更大的挑戰(zhàn)。念珠菌血癥預(yù)后受到多種因素影響，包括合理抗真菌治療等。
　　念珠菌血癥的臨床診斷比較困

2、難，目前主要依賴于常規(guī)的分離培養(yǎng)方法，但其周期長(zhǎng)且陽(yáng)性率低，而真菌特異性抗原、抗體和代謝產(chǎn)物的血清學(xué)方法則存在敏感性及特異性低的缺陷。基因芯片技術(shù)（又名DNA芯片、DNA微陣列）是分子雜交基礎(chǔ)上衍生的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，可快速將致病菌鑒定種，能進(jìn)行大批量基因檢測(cè)，從而提高診斷效率。
　　第一部分 念珠菌血癥臨床分析
　　本部分檢索、收集2007年1月1日至2012年12月31日期間復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院所有血培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性的住院患者

3、病歷資料，回顧患者病歷記錄，整理性別、年齡、科室、基礎(chǔ)疾病、致病菌種等基本資料，記錄臨床表現(xiàn)、治療和轉(zhuǎn)歸。上述資料的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，念珠茵血癥病原菌種包括白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等，常見基礎(chǔ)疾病包括實(shí)體腫瘤，胃腸道手術(shù)史、糖尿病等。留置深靜脈導(dǎo)管、合理抗真菌治療為影響預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　第二部分 念珠菌血癥病原基因芯片檢測(cè)方法的建立
　　本部分建立了基因芯片技術(shù)鑒定臨床常見念珠菌的分子生物學(xué)

4、方法。PCR擴(kuò)增臨床常見念珠菌DNA所用的通用引物是根據(jù)真菌的2個(gè)18S rDNA保守區(qū)序列而設(shè)計(jì)，用此引物擴(kuò)增念珠菌屬DNA，并通過(guò)在PCR引物上標(biāo)記熒光基團(tuán)，使擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶可被檢測(cè)熒光信號(hào)。根據(jù)18S rDNA保守序列之間可變區(qū)設(shè)計(jì)合成了6種臨床常見致病念珠菌（白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌）的特異性探針。并同時(shí)設(shè)計(jì)新型隱球菌特異探針、曲霉通用探針以檢測(cè)血培養(yǎng)報(bào)警標(biāo)本中可能存在的真菌性病原。

5、將所有探針固定于同一張芯片片基上，與標(biāo)記熒光的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，可將6種常見致病念珠菌鑒定到種的水平。結(jié)果顯示，此6種念珠菌探針不與細(xì)菌和人類DNA分子發(fā)生非特異雜交，此方法具有高度的特異性。雜交的檢測(cè)下限為100個(gè)真菌細(xì)胞/PCR反應(yīng)，具有很好的敏感性。
　　第三部分 念珠菌血癥病原基因芯片檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用
　　收集2011年3月至2012年3月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科血培養(yǎng)機(jī)器報(bào)警陽(yáng)性的血液樣本440例，其中真菌陽(yáng)