口蹄疫-水皰性口炎-豬水皰病聯(lián)合共檢基因芯片的構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫、豬水皰病和水皰性口炎分別是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，F(xiàn)MDV)、豬水皰病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)和水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的急性動(dòng)物傳染病，都可以感染豬，且由于發(fā)病癥狀相似，從發(fā)病癥狀上鑒別難度較大，因此構(gòu)建一種能同時(shí)鑒別診斷三種疾病和區(qū)分口蹄疫三種血清型的高通量聯(lián)合檢測(cè)方法具

2、有重要意義。本研究以FMDV O型、A型、Asia1型、VSV和SVDV為研究對(duì)象，建立了寡核苷酸基因芯片檢測(cè)體系。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.共檢基因芯片的靶基因引物和探針的構(gòu)建:
　　參考GenBank中已公布的基因組序列，根據(jù)基因芯片引物設(shè)計(jì)要求，選擇三種病毒的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)引物和探針進(jìn)行了驗(yàn)證，構(gòu)建了基于口蹄疫病毒的A、O、Asia1型VP1序列、VSV的L基因和SVDV VP1序列的pMD19-T克隆質(zhì)粒并

3、測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，克隆的靶基因與NCBI公布的序列一致性均在95％以上。
　　2.共檢基因芯片的構(gòu)建和優(yōu)化
　　設(shè)計(jì)了基因芯片矩陣和位置指控、雜交質(zhì)控及雜交質(zhì)控探針序列，并對(duì)三種病毒的探針進(jìn)行了篩選。對(duì)芯片點(diǎn)樣后的水化溫度與封閉條件、PCR退火溫度和循環(huán)數(shù)、熒光基團(tuán)標(biāo)記引物的使用量、雜交溫度等進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:使用醛基基片，在18℃-37℃水化過(guò)夜，使用含0.25％BH4Na，25％乙醇的封閉液進(jìn)行封閉所制的芯片效果較

4、好;PCR擴(kuò)增時(shí)選擇58℃退火溫度，一般使用2μL熒光基團(tuán)標(biāo)記引物，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)便可得到足夠的產(chǎn)物;在臨床檢測(cè)時(shí)為提高靈敏度可使用4-8μL熒光基團(tuán)標(biāo)記引物，擴(kuò)增40-50個(gè)循環(huán)，雜交溫度達(dá)到42℃便可獲得有意義的結(jié)果，為保證特異性，在52℃進(jìn)行雜交效果更好。
　　3.共檢基因芯片的效果評(píng)價(jià)
　　對(duì)所構(gòu)建的基因芯片檢測(cè)方法進(jìn)行了靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的FMDV-O引物PCR檢

5、測(cè)限為0.1180ng/mL，F(xiàn)MDV-A為0.0184ng/mL，F(xiàn)MDV-Asia(l)為0.129ng/mL，VSV為0.0267ng/mL，SVDV為0.0247ng/mL，芯片檢測(cè)方法靈敏度至少比PCR檢測(cè)高一個(gè)數(shù)量級(jí);特異性良好，所設(shè)計(jì)引物沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，能準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)出FMDV、VSV、SVDV，并能區(qū)分出口蹄疫病毒的三種血清型;應(yīng)用了兩家公司所生產(chǎn)的不同批次醛基基片進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，均能夠較好地實(shí)現(xiàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn);將點(diǎn)制好