水皰性口炎病毒糖蛋白截短后在大腸桿菌中的表達(dá)和診斷技術(shù)的研究.pdf

1、水皰性口炎(VesicularStomatitis，VS)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病，在我國(guó)進(jìn)出境動(dòng)物檢疫對(duì)象中被列為二類病，盡管目前我國(guó)還沒(méi)有該病流行的報(bào)道，但隨著我國(guó)加入WTO，動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易增加，為防止國(guó)外疫情流入我國(guó)，保護(hù)我國(guó)畜牧業(yè)的健康發(fā)展，有必要對(duì)該病進(jìn)行研究。 VS由彈狀病毒科水皰病毒屬的水皰性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus，VSV)引起的牛、馬、豬等多種哺乳動(dòng)

2、物的一種急性、高度接觸性傳染病。VSV由5種不同的主要蛋白構(gòu)成，分別為核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基質(zhì)(M)蛋白、糖(G)蛋白及RNA聚合酶(L)蛋白，其中核蛋白和糖蛋白在病毒免疫和診斷具有重要的意義；N蛋白是病毒衣殼蛋白，由N基因編碼，呈群特異性，刺激機(jī)體產(chǎn)生非中和抗體；G蛋白由G基因編碼，是病毒的主要抗原，決定著病毒的毒力，也是病毒的保護(hù)性抗原，它能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，呈現(xiàn)型、亞型、乃至株的特異性。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用P

3、CR技術(shù)擴(kuò)增編碼水皰性口炎病毒IND型(VSV-IND)糖蛋白(G)基因不含信號(hào)肽、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的主要抗原表位區(qū)，通過(guò)引入其兩端的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)定向插入到pET-30c質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游的多克隆區(qū)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30c-vsvG并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)株中。用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳表明重組蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，經(jīng)過(guò)4h表達(dá)量即可達(dá)到高峰，重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為57ku

4、；Western-blot檢測(cè)證明，所表達(dá)的重組蛋白能被VSV-IND陽(yáng)性血清所識(shí)別。 重組蛋白含有六聚組氨酸尾，主要以包涵體形式存在，經(jīng)鎳柱純化后作為包被抗原建立了間接ELISA，試驗(yàn)證明其具有較高的抗原活性，且具有良好的型特異性，純化后的重組蛋白有望在LP-ELISA中取代全病毒成為標(biāo)準(zhǔn)的診斷抗原和用于基因工程疫苗的研制。 本研究還針對(duì)FMDV的3D基因、SVDV的VP1基因與VSV的N基因設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，建立了多重