LDR-PCR基因芯片檢測(cè)混合感染豬病毒研究.pdf

1、隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程的加快,動(dòng)物的國際貿(mào)易日益頻繁,貿(mào)易規(guī)模越來越大,經(jīng)典的血清學(xué)和PCR檢測(cè)方法已經(jīng)無法適應(yīng)進(jìn)口動(dòng)物檢疫快速、準(zhǔn)確、高通量的要求。在很多檢測(cè)領(lǐng)域都急需一種能同時(shí)對(duì)多種病原微生物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的方法。本研究建立了一種基于LDR-PCR基因芯片技術(shù)可同時(shí)對(duì)六種與呼吸、繁殖疾病相關(guān)的豬病毒進(jìn)行鑒定的檢測(cè)方法。LDR-PCR方法用于特異和靈敏地?cái)U(kuò)增病毒基因片段,基因芯片方法有助于實(shí)現(xiàn)方法的多重性。連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)使用

2、耐熱的DNA連接酶,當(dāng)探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì)后,連接酶能通過催化磷酸二酯鍵將相鄰的兩條探針連接,當(dāng)探針的接頭處存在堿基錯(cuò)配,連接反應(yīng)便不能進(jìn)行。這種方法顯著減少了探針非特異性連接,被廣泛用于檢測(cè)病原體基因突變、插入和缺失等。基因芯片技術(shù)最早用于監(jiān)控基因表達(dá)和DNA序列特異性的點(diǎn)突變,目前較多地應(yīng)用于環(huán)境和臨床中的病原微生物檢測(cè)鑒定?；蛐酒瑸榉肿釉\斷技術(shù)帶來巨大的革命,不僅提高了檢測(cè)能力,同時(shí)也增加了檢測(cè)的通量。雖然這種技術(shù)具有高通量

3、、高集成及微型化的突出優(yōu)點(diǎn),但仍有一些不足,如靈敏度和特異性不高。
　　 本文在整合LDR、PCR和基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了一種同時(shí)檢測(cè)六種豬病毒的方法。首先,從NCBI中查找并下載六種豬病毒的全序列,通過軟件比對(duì)確定每種病毒序列的保守區(qū),根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)一組LDR探針,每組探針由五段序列組成,從左到右依次是:上游通用序列,上游病毒特異序列,下游病毒特異序列,Zip-code序列和下游通用序列。提取基因組DNA/RNA,以提

4、取出的DNA或反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板進(jìn)行多重LDR,并以含病毒診斷區(qū)的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板對(duì)多重連接反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,研究了最佳的反應(yīng)條件。利用通用引物擴(kuò)增標(biāo)記連接產(chǎn)物,最后將擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物與通用芯片雜交檢測(cè)鑒定靶標(biāo)序列。本研究建立的基于LDR-PCR基因芯片檢測(cè)方法可以同時(shí)區(qū)分六種豬病毒,LDR探針和Zip-code序列的特異性良好,只在芯片目的位點(diǎn)產(chǎn)生信號(hào),其它位點(diǎn)無信號(hào)。此方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到10個(gè)拷貝,存在兩種靶基因時(shí),其中一種病