犬常見病毒病診斷基因芯片的研究與應(yīng)用.pdf

1、本文對(duì)犬常見病毒病診斷基因芯片進(jìn)行了研究。文章在獲得犬腺病毒(CAV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病病毒RV)病原的基礎(chǔ)上，選取各病毒基因保守序列，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，提取質(zhì)粒模板，擴(kuò)增純化作為探針，應(yīng)用微量點(diǎn)樣技術(shù)將探針固定在硝酸素纖維膜上，80℃烤膜2h后，制備完成診斷基因芯片。然后提取樣品中的核酸(RNA病毒核酸首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄)在PCR擴(kuò)增中用生物素標(biāo)記，并將所獲

2、得的擴(kuò)增產(chǎn)物與診斷基因芯片進(jìn)行特異性的逆向點(diǎn)雜交，通過芯片掃描來實(shí)現(xiàn)對(duì)犬多種病原的高效檢測(cè)和分析判斷。 通過PCR或RT-PCR方法，分別擴(kuò)增六種病原的保守核酸片斷，用做對(duì)基因芯片進(jìn)行質(zhì)量控制，即對(duì)敏感性、特異性、重復(fù)性做了相應(yīng)試驗(yàn)，通過試驗(yàn)確定了在42℃下最優(yōu)的雜交條件及雜交環(huán)境。將RV細(xì)胞培養(yǎng)液作10倍倍比稀釋后，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，可檢測(cè)到的陽(yáng)性雜交信號(hào)的最大稀釋度為10-11，而凝膠電泳僅能檢測(cè)到10-7，這說明芯片的靈敏度

3、是PCR的104倍。用七種混合引物，空缺單個(gè)模板，經(jīng)過生物素標(biāo)記的(RT)PCR后分別與基因芯片進(jìn)行雜交，試驗(yàn)結(jié)果表明：在相應(yīng)雜交位點(diǎn)和陽(yáng)性位點(diǎn)出現(xiàn)了特異性雜交點(diǎn)，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)雜交信號(hào)，各位點(diǎn)重復(fù)性結(jié)果良好。通過試驗(yàn)對(duì)基因芯片制備的優(yōu)化條件進(jìn)行了探索，最終選擇本底好、遇溶液不變形、點(diǎn)不易擴(kuò)散的美國(guó)Millipore公司的0.45μm混合纖維素酯膜作為基底膜，選用靈敏度、特異性好的biotin-16-dUTP標(biāo)記探針方法。

4、 應(yīng)用基因芯片、ELISA診斷試劑、病毒分離和PCR方法，對(duì)258份疑似病料進(jìn)行了檢測(cè)效果的對(duì)比研究。研究結(jié)果表明：應(yīng)用基因芯片方法對(duì)CCV和CDV檢測(cè)率比ELISA法分別高出23.4％、23.4％；對(duì)CPV和CPIV的檢測(cè)率比病毒分離培養(yǎng)方法分別高出22.8％、10.5％；對(duì)CAV和RV比PCR方法檢出率分別高出5.3％、1.7％?；蛐酒ㄍ《痉蛛x法、免疫法的符合率低，差異極顯著(p＜0.01)，與PCR法符合率在90％以