具有高傳播能力的栗疫菌低毒力病毒CHV1-CN280的基因組序列測(cè)定與可侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建.pdf

1、栗疫菌細(xì)胞中的低毒力病毒是一類(lèi)沒(méi)有衣殼的雙鏈RNA病毒，可以使寄主栗疫菌的毒力、分生孢子和色素的產(chǎn)量降低，并引起雌性不育。低毒力病毒的發(fā)現(xiàn)為栗疫病的生物防治提供了一種全新的思路。低毒力病毒缺少細(xì)胞外的傳播途徑，可以通過(guò)感染菌株與未感染菌株間的菌絲融合進(jìn)行傳播，但是這種傳播受到營(yíng)養(yǎng)體不親和性的限制。
　　 本研究通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)3個(gè)CHV1低毒力病毒在栗疫菌各營(yíng)養(yǎng)體親和群菌株間的重復(fù)傳播實(shí)驗(yàn)，量化分析了3個(gè)病毒在相差1.2個(gè)v

2、ic基因位點(diǎn)時(shí)傳播效率的差異，首次直接證明了低毒力病毒CHV1在栗疫菌菌株間的水平傳播受到病毒毒株的影響。結(jié)果表明，不同的CHV1低毒力病毒具有不同的水平傳播能力，與其他兩種已經(jīng)測(cè)序并構(gòu)建了全長(zhǎng)可侵染性cDNA克隆的低毒力病毒CHV1-Euro7和CHV1-EP713相比，來(lái)自中國(guó)的CHV1-CN280具有最高的傳播能力。而在國(guó)際上，之前的研究普遍認(rèn)為關(guān)于低毒力病毒自身對(duì)其水平傳播的沒(méi)有影響。這一發(fā)現(xiàn)為選擇高效栗疫病生防病毒提供了新的指

3、標(biāo)，提示通過(guò)發(fā)現(xiàn)和使用傳播能力更高的低毒力病毒，將會(huì)顯著提高對(duì)栗疫病的生物防治效率。
　　 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫(kù)并結(jié)合RT-PCR,對(duì)來(lái)自中國(guó)的低毒力病毒CHV1-CN280進(jìn)行了基因組全長(zhǎng)測(cè)序。CHV1-CN280的基因組全長(zhǎng)12730bp(包括po1yd(A)的26bp)，序列分析表明，CHV1-CN280與已經(jīng)測(cè)序的3個(gè)CHV1病毒在基因組上具有相似的結(jié)構(gòu)。在核苷酸水平水平上CHV1-CN280和CHV1-Euro7

4、有61-93％的序列同源性；與CHV1-EP713有60-90％的同源性。在氨基酸水平上CHV1-CN280和CHV1-Euro7有59-95％的同源性，與CHV1-EP713有61-94％的同源性。CHV1-CN280的3，端與已經(jīng)測(cè)序的3個(gè)CHV1病毒同源性較高，但在5’端，CHV1-CN280與已經(jīng)測(cè)序的3個(gè)CHV1病毒在核酸和蛋白序列上差異巨大。已經(jīng)測(cè)序的4個(gè)低毒力病毒CHV1-EP713、CHV1-Euro7、CHV1-EP7

5、21和CHV2-NB58，在ORFA和ORFB之間都有一個(gè)UAAUG五核苷酸的連接區(qū)，其中AUG作為ORFB的起始密碼子，UAA作為ORFA的終止密碼子；而在CHV1-CN280中，ORFA和ORFB之間的連接區(qū)是AUGUAUAA八個(gè)核苷酸。設(shè)計(jì)了一對(duì)RT-PCR引物(A2275/B2915)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的12個(gè)CHV1病毒的ORFA和ORFB的連接區(qū)的序列測(cè)定表明，這種AUGUAUAA八核苷酸的連接方式和UAAUG五核苷酸的連接方式

6、一樣常見(jiàn)。設(shè)計(jì)了另一對(duì)RT-PCR引物(A364/B1402)用于測(cè)定本實(shí)驗(yàn)室保存的CHV1病毒的5'UTR和ORFA的部分序列以研究CHV1病毒的生物多樣性。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物在所有12個(gè)CHV1病毒的cDNA中都能很好的擴(kuò)增出特異性的目標(biāo)片段。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在之前研究中對(duì)其他CHV1病毒的部分測(cè)序結(jié)果，對(duì)總共36個(gè)CHV1病毒進(jìn)行了群體遺傳分析。分析結(jié)果表明CHV1病毒具有復(fù)雜的遺傳多樣性，36個(gè)CHV1病毒可以被劃分為包含8個(gè)亞

7、型的2個(gè)群體，而之前已經(jīng)測(cè)序的3個(gè)低毒力病毒CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚集在一個(gè)很小的區(qū)域內(nèi)。鑒于南方群體和北方群體間的巨大遺傳差異，以及北方群體的CHV1-CN80與南方群體的CHV1-Euro7、CHV1-EP713和CHV1-EP721的全基因組序列比較結(jié)果，建議CHV1病毒應(yīng)該劃分為兩個(gè)亞種(subspecies)。
　　 根據(jù)已經(jīng)測(cè)序的低毒力病毒CHV1-CN280基

8、因組全長(zhǎng)cDNA序列信息，運(yùn)用RT-PCR得到包含CHV1-CN280全部基因組序列的一系列cDNA片段的克隆，逐步通過(guò)酶切和連接，得到了CHV1-CN280全長(zhǎng)12.7kb的cDNA克隆。體外轉(zhuǎn)錄成為單鏈RNA后在由電擊轉(zhuǎn)染栗疫菌原生質(zhì)體，成功的在栗疫菌中再生出CHV1-CN280的病毒dsRNA，并表現(xiàn)出CHV1-CN280的一系列特性。CHV1-CN280感染不同宿主后表型相似，都和野生帶毒菌株CN280表型一樣菌體呈白色，可以產(chǎn)

9、生少量分生抱子；在供體－受體菌株相差一個(gè)vicAa基因時(shí)，再生出的CHV1-CN280病毒具有和野生CHV1-CN280病毒相似的傳播能力，都顯著高于CHV1-EP713。CHV1-CN280的侵染性克隆的獲得，為進(jìn)一步通過(guò)對(duì)CHV1-CN280、CHV1-Euro7和CHV1-EP713的區(qū)段互換，構(gòu)建一些重組病毒來(lái)確定決定CHV1病毒水平播能力的關(guān)鍵位點(diǎn)、闡明CHV1-CN280高傳播能力的分子生物學(xué)機(jī)制、設(shè)計(jì)和構(gòu)建表型性狀更好轉(zhuǎn)基