氟苯尼考致小鼠L細(xì)胞毒副作用的線粒體途徑的研究.pdf

1、隨著我國畜牧養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，畜禽疫病防控的壓力日益增大，多病原混合感染特別是細(xì)菌繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍，大量抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病的預(yù)防及獸醫(yī)臨床治療，并在飼料中被大量添加以提高飼料轉(zhuǎn)化率或達(dá)到促生長的目的。在此背景下，畜禽生產(chǎn)中濫用和亂用抗菌藥物的現(xiàn)象十分普遍，這給人畜健康和細(xì)菌病的防控帶來了巨大挑戰(zhàn)。氟苯尼考（FLO）是一種獸醫(yī)臨床專用的新型廣譜抗菌藥物，目前已成為畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用范圍最廣、使用量最大的抗菌藥物之一?！?/p>

2、內(nèi)共生學(xué)說”指出真核生物的線粒體起源于古細(xì)菌，古細(xì)菌寄生于原始生物后隨著長時間的互利共生與演化過程而演變成了細(xì)胞線粒體，因此線粒體核糖體在結(jié)構(gòu)和功能上與細(xì)菌核糖體具有較高的相似性?；诖耍婧思?xì)胞線粒體的核糖體便很容易受到特定抗菌藥物的干擾，并給動物機(jī)體或細(xì)胞帶來嚴(yán)重的毒副作用。FLO能夠與細(xì)菌核糖體A位點緊密結(jié)合而抑制肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性，最終通過影響蛋白質(zhì)的合成而殺滅細(xì)菌，同時也會影響真核細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)的合成。隨著FLO的大量應(yīng)用，關(guān)

3、于其毒副作用尤其是造血免疫毒性和胚胎毒性的報道也越來越多，但都基于FLO對機(jī)體生理機(jī)能或組織器官功能的影響觀察或檢測，尚未見到在細(xì)胞分子水平上研究FLO毒副作用的報道。為明確FLO對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的具體影響，及其對細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的毒副作用，本研究以成纖維細(xì)胞為研究對象，在細(xì)胞及分子水平上研究了FLO對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響，以及線粒體損傷對細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活及線粒體自噬的影響及其機(jī)制，從分子水平揭示了FLO致成纖維細(xì)胞毒

4、性的具體機(jī)制。
　　一、FLO誘導(dǎo)線粒體結(jié)構(gòu)與功能損傷
　　線粒體作為真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對細(xì)胞的生命活動來說至關(guān)重要。本研究首先聚焦在FLO對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響方面，選用不同劑量的FLO（0.4、0.1、0.025 mg/mL）處理細(xì)胞48 h后，主要進(jìn)行以下實驗：
　?、賅estern blot分別檢測FLO對線粒體核糖體編碼的蛋白質(zhì)Cox I及細(xì)胞質(zhì)核糖體編碼的蛋白質(zhì)白Cox

5、IV的表達(dá)水平的影響；
　?、谕干潆婄R檢查FLO對細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響；
　　③流式細(xì)胞術(shù)分別檢測FLO對線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）生成量的影響；
　　④生化方法分別測定FLO對線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、II及IV的催化活性及細(xì)胞內(nèi)ATP生成量的影響。結(jié)果表明：FLO能夠顯著抑制由線粒體核糖體翻譯的線粒體蛋白如Cox I的表達(dá)，進(jìn)而顯著下調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合體I及IV的活性（p＜0.01）、顯著降低線

6、粒體膜電位（p＜0.05或 p＜0.01）及胞內(nèi)ATP的水平（p＜0.05或 p＜0.01）并提高ROS的生成量；從結(jié)構(gòu)上來說，F(xiàn)LO處理后的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了腫脹、空泡化、嵴消失的損傷線粒體。以上結(jié)果表明線粒體正常的結(jié)構(gòu)和生理功能受到了FLO的嚴(yán)重影響。
　　二、FLO誘導(dǎo)的線粒體功能障礙抑制細(xì)胞增殖活性
　　正常線粒體在細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖發(fā)育等方面具有重要作用，鑒于FLO可以造成明顯的線粒體功能障礙，我們隨后從以下幾方面研

7、究了FLO對細(xì)胞存活、細(xì)胞周期和增殖調(diào)控的影響：
　?、俨煌瑒┝縁LO分別處理細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h，通過細(xì)胞計數(shù)研究細(xì)胞增殖曲線；
　　②CCK-8還原法測定不同劑量FLO處理細(xì)胞24 h、48 h及72 h對細(xì)胞增殖活性的影響；
　?、跡dU摻入實驗檢測不同劑量FLO處理48 h對細(xì)胞DNA復(fù)制活性的影響；
　　④流式細(xì)胞術(shù)檢測不同劑量FLO對細(xì)胞周期分布的影響；

8、>　?、萘魇郊?xì)胞術(shù)及caspase-3活性分析實驗檢測FLO對細(xì)胞凋亡的影響；
　?、奕樗崦摎涿福↙DH）釋放實驗檢測FLO對細(xì)胞死亡率的影響；
　　⑦Western blot檢測FLO對細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)信號通路活化狀態(tài)的影響。
　　結(jié)果表明：
　　①FLO能導(dǎo)致與劑量有關(guān)的細(xì)胞活力降低，表現(xiàn)在細(xì)胞絕對數(shù)量的下降和增殖活力的降低（p＜0.01）；
　?、贓dU摻入試驗及細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明FLO能顯著降低發(fā)生

9、DNA復(fù)制的細(xì)胞比例，并使細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯（p＜0.05或p＜0.01）；
　?、圻x用D-半乳糖培養(yǎng)基迫使細(xì)胞只能通過線粒體呼吸鏈供能以便于使線粒體毒性物質(zhì)對線粒體的毒副作用表現(xiàn)得更為明顯，給予FLO后發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞表現(xiàn)出了更為嚴(yán)重的細(xì)胞活力抑制作用（p＜0.01），表明FLO對線粒體呼吸鏈的損傷與其所致的細(xì)胞活力下降直接相關(guān)；
　　④FLO對細(xì)胞凋亡率和壞死率無明顯影響（p＞0.05），說明FLO所致細(xì)胞活力下降

10、僅與細(xì)胞增殖減緩有關(guān)，與細(xì)胞死亡則無明顯關(guān)聯(lián)；
　　⑤從機(jī)制上來說，F(xiàn)LO活化了AMPK-mTOR-p70S6K通路，即FLO使活化的AMPK（磷酸化）表達(dá)上調(diào)、磷酸化的mTOR及磷酸化的p70S6K表達(dá)下調(diào)，同時ROS-p53-p21通路也被活化，AMPK特異性抑制劑Compound C和抗氧化劑NAC分別能夠特異性抑制上述相應(yīng)通路的活化并提高被FLO抑制的細(xì)胞增殖活性（p＜0.05或p＜0.01）。
　　三、FLO導(dǎo)致細(xì)

11、胞內(nèi)損傷線粒體清除障礙及細(xì)胞衰老發(fā)生
　　線粒體自噬對損傷線粒體的清除和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，鑒于FLO可以造成明顯的線粒體功能障礙，我們隨后從以下幾方面研究了FLO對細(xì)胞內(nèi)損傷線粒體的清除過程即線粒體自噬的影響：
　?、賅estern blot檢測FLO對胞內(nèi)線粒體質(zhì)量（線粒體內(nèi)膜蛋白Tim23水平）的影響；
　?、谑褂镁€粒體特異性探針MitoTracker Green染色線粒體，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測FLO對細(xì)胞內(nèi)線

12、粒體數(shù)量的影響；
　?、凼褂米允上嚓P(guān)蛋白LC3的特異性抗體染色結(jié)合共聚焦顯微鏡檢查FLO處理的細(xì)胞內(nèi)自噬點的形成情況；
　?、躓estern blot檢測FLO對自噬相關(guān)蛋白LC3B II/I及p62的表達(dá)水平，以評估細(xì)胞自噬水平；
　　⑤衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測FLO處理8 d所造成的的損傷線粒體累積對細(xì)胞衰老水平的影響；
　?、轜estern blot檢測FLO對招募至損傷線粒體的線粒體自噬起始關(guān)鍵蛋白

13、Parkin及p62水平的影響，結(jié)合ROS清除劑NAC研究p53蛋白對Parkin向線粒體轉(zhuǎn)位的影響；
　?、進(jìn)itoTracker Green染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NAC對線粒體自噬或損傷線粒體清除功能的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果表明：
　?、偌?xì)胞自噬功能在FLO處理的細(xì)胞中處于抑制狀態(tài)，表現(xiàn)在自噬相關(guān)蛋白LC3B II下降和p62蛋白表達(dá)水平上升，細(xì)胞內(nèi)LC3熒光聚點的數(shù)量在不同處理組間無顯著差異；
　?、诎麅?nèi)線粒

14、體內(nèi)膜蛋白Tim23的水平在FLO給藥后輕微升高，F(xiàn)LO處理組的Mitotracker Green熒光值顯著升高，表明FLO處理后損傷的線粒體并不能通過自噬有效清除，而是堆積在細(xì)胞內(nèi)；
　?、跴arkin蛋白從胞漿被招募到線粒體是線粒體自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)FLO處理后線粒體膜上Parkin蛋白的量及其招募的p62蛋白的量都未升高，表明FLO所致線粒體自噬異常與Parkin蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位障礙有關(guān)；
　　④使用NAC和F

15、LO共處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)Parkin蛋白線粒體轉(zhuǎn)運障礙能夠得到緩解，結(jié)合先前p53蛋白抑制Parkin蛋白線粒體轉(zhuǎn)位的報道可知，F(xiàn)LO處理活化了ROS-p53通路并通過抑制Parkin蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位發(fā)揮線粒體自噬抑制效應(yīng)，進(jìn)而使損傷的線粒體得不到有效清除并最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老的發(fā)生。
　　本研究從分子水平揭示了氟苯尼考致成纖維細(xì)胞毒性的具體機(jī)制，研究結(jié)果對于明確線粒體毒性藥物的毒性機(jī)制具有重要借鑒意義，有助于指導(dǎo)氟苯尼考在畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖