柑橘潰瘍病菌單鏈二硫鍵穩(wěn)定重組抗體的設(shè)計(jì)構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、柑橘潰瘍病(CBCD)是危害世界柑橘產(chǎn)業(yè)的重要病害之一，為國(guó)內(nèi)外檢疫的重要對(duì)象。在我國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，南方各省尤為嚴(yán)重，它是由黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xcc）引起，病菌主要侵染蕓香科植物，以甜橙、臍橙、酸橙、檸檬等品種，危害柑橘葉片、枝梢、果實(shí)，以苗木、幼樹(shù)受害最重，造成落葉、枯梢、樹(shù)勢(shì)衰弱、落果等，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。可危害蕓香科數(shù)十種植物，傳播途徑廣、傳染迅速、危害嚴(yán)重，頑固難防。當(dāng)前田間主要使用銅基殺菌劑和抗生素制劑，但防效不佳

2、，而對(duì)于已患病的植株則采取連根拔除，集中焚毀的手段進(jìn)行根除。目前我國(guó)正在進(jìn)行柑橘非疫區(qū)建設(shè)，因此開(kāi)展柑橘潰瘍病菌的快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)研究具有重要意義。
　　 單鏈抗體(scFv)是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段，分子量約為完整抗體分子的1/6，其優(yōu)越性在于可通過(guò)包涵體大量表達(dá)、易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白，基于這些特點(diǎn)，重組抗體在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用前景已引起廣泛的關(guān)注。重慶大學(xué)基因工程研究中心利用柑橘

3、潰瘍病菌制備了柑橘潰瘍病菌的單鏈重組抗體及二硫鍵穩(wěn)定性抗體，但是scFv的穩(wěn)定性欠佳，并且容易發(fā)生聚集，在制備過(guò)程中難以得到較高濃度的活性蛋白。二硫鍵穩(wěn)定Fv抗體(dsFv)比單鏈抗體更加穩(wěn)定，但是該種抗體也具有產(chǎn)量很低且復(fù)性效率不高的缺陷。為此，采用在二硫鍵穩(wěn)定抗體dsFv的基礎(chǔ)上再引入一條連接肽序列以連接VH和VL基因的方法，將這兩種抗體的優(yōu)點(diǎn)集合研發(fā)一種新型抗體，即獲得了穩(wěn)定性更佳的單鏈-二硫鍵穩(wěn)定抗體(sc-dsFv)抗體。

4、r>　　 本研究的目的在于針對(duì)柑橘潰瘍病scFv抗體穩(wěn)定性較差及dsFv抗體具有的產(chǎn)量很低且復(fù)性效率不高的缺陷，構(gòu)建一種穩(wěn)定性和復(fù)性效率都較高的新型抗體，以克服前二者的缺陷，并為今后柑橘潰瘍病菌Xcc的免疫診斷和防治研究提供新的工具和途徑。
　　 研究的主要內(nèi)容包括：在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得二硫鍵穩(wěn)定抗體的基礎(chǔ)上本研究以鼠源抗柑橘潰瘍病菌表面脂多糖的二硫鍵穩(wěn)定性抗體dsFv為模板，利用重疊延伸PCR在重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL之間

5、引入一條人類抗體重鏈恒定區(qū)1(CH1)的5'端12個(gè)氨基酸的序列作為連接肽，構(gòu)建重組單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體基因，將其連接入pET24a(+)原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，經(jīng)表達(dá)、復(fù)性并純化后得到高純度的sc-dsFv抗體，并對(duì)其特異性、親和力和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定研究。本研究已獲得主要研究結(jié)果如下：
　　 ①分別以dsFv-VL基因和dsFv-VH基因?yàn)槟０逋ㄟ^(guò)一輪PCR擴(kuò)增，在重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)V

6、L之間分別引入一條人類抗體重鏈恒定區(qū)1(CH1)的5'端12個(gè)氨基酸的序列作為連接肽，再經(jīng)過(guò)一輪重疊延伸PCR將輕鏈基因與重鏈基因融合構(gòu)建sc-dsFv重組抗體基因，經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明基因序列正確，連接肽序列被成功引入兩段基因之間。
　　 ②構(gòu)建好的基因序列經(jīng)酶切后連接表達(dá)載體pET24a(+)，并轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)菌種BL21(DE3)中。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，獲得包涵體表達(dá)蛋白。對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western bl

7、ot雜交，電泳結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白分子量為30kDa，Western blot雜交結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白表達(dá)正確與預(yù)期構(gòu)想一致，即重組抗體sc-dsFv成功在原核表達(dá)載體中以包涵體形式超表達(dá)，經(jīng)計(jì)算每百毫升菌液產(chǎn)包涵體約0.2g。
　　 ③誘導(dǎo)表達(dá)獲得的sc-dsFv包涵體經(jīng)鹽酸胍溶解后稀釋于復(fù)性緩沖液中復(fù)性，利用Ni-NTA柱對(duì)復(fù)性后的Xcc-sc-dsFv進(jìn)行純化，灰度分析表明其純度約為90％。
　　 ④用大分子相互作用儀(b

8、iacore)分析Xcc-sc-dsFv抗體的親和力，結(jié)果表明Xcc-sc-dsFv對(duì)其抗原Xcc的脂多糖LPS具有較高的親和力，結(jié)合常數(shù)(ka)為5.31×106 M-1·s-1，解離常數(shù)(kd)為5.53×10-2 s-1，親和常數(shù)(KD)為1.04×10-8M；Dot-blot和ELISA的特異性檢測(cè)，顯示出sc-dsFv抗體對(duì)目的抗原菌Xcc特異性結(jié)合活性良好，對(duì)其它十種近源菌無(wú)結(jié)合活性。
　　 ⑤以抗柑橘潰瘍病scFv

9、抗體和dsFv抗體為對(duì)照，檢測(cè)所獲得的sc-dsFv的貯存穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在各種溫度處理中，三種抗體中，scFv的貯存穩(wěn)定性最低，dsFv的貯存穩(wěn)定性次之，sc-dsFv的穩(wěn)定性最高。在37℃條件下，scFv在12 h內(nèi)，活性急劇下降到最初活性的23.7％，dsFv在12 h后活性部分下降并在72 h后保持最初活性的63.2％，而sc-dsFv的活性一直略高于dsFv直到48小時(shí)后基本與其一致。scFv在35℃孵育3 h活性迅速下降至

10、最初的17.2％，已經(jīng)基本失活，45℃孵育3 h后dsFv仍具有58.6％的活性，在55℃孵育3 h后基本無(wú)活性，sc-dsFv在45℃-55℃之間的活性略高于dsFv。在-20℃凍存試驗(yàn)中scFv的活性在一周之內(nèi)下降至20％左右，在60天之內(nèi)活性完全消失。dsFv和sc-dsFv的活性隨著時(shí)間的推移都有所下降，在第150天后前者的活性降低至50％左右，而sc-dsFv活性保持在70％左右。說(shuō)明sc-dsFv抗體的穩(wěn)定性與dsFv相比有